海藻酸钠固定化脂肪酶的制备及性质研究
作者： 金红娣 王巧映 余凯 董华平 来源：《科技创新导报》 2012年第14期
基金项目：浙江省实验教学示范中心实验教学改革项目资助项目和绍兴文理学院学生科研资助项目。
作者简介：金红娣，（1990-），女，浙江萧山人，研究方向为生物制药。
董华平，（1977-），男，博士，浙江上虞人，研究方向为生物化工
金红娣 王巧映 余凯 董华平
(绍兴文理学院化学化工学院 浙江绍兴 312000)
摘要：本文采用海藻酸钠包埋法得到了固定化脂肪酶。通过条件优化得到了最佳固定化条件：海藻酸钠浓度1.5%，CaCl2浓度3%，固定化时间为1 h。该固定化脂肪酶连续反应4批之后，酶活保持稳定，显示了较好的催化稳定性。
关键词：海藻酸钠 脂肪酶 固定化 催化稳定性
中图分类号：TQ 文献标识码：A
文章编号：1674-098X（2012）05（b）-0000-00
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，又称甘油三酯水解酶，是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸的酶类，许多脂肪酶还能催化酯化反应酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。目前，脂肪酶已广泛应用于食品、医药、皮革、日用化工等行业。但游离脂肪酶稳定性差、容易失活、难以回收利用等缺点，了其在工业生产中的应用。通过固定化技术，将脂肪酶固定化在一定的载体上可以提高活力和稳定性，而且易于回收重复使用，因此酶固定化技术被广泛地应用，以降低生产成本、提高生产效率[1,2]。海藻酸钠作为一种生物相容性较好、机械强度较高、对酶蛋白无毒副作用的高分子载体，经常用于酶催化剂的固定化[3,4]。
本文以海藻酸钠作为载体，制备固定化脂肪酶，并对固定化条件和酶学性质作了详细的研究。
1实验部分
1.1仪器与试剂
恒流泵（苏州江东精密仪器有限公司，BT-100B），恒温水浴振荡器（太仓市实验设备厂，SHZ-88A），多能搅拌器（金坛市白塔金昌实验仪器厂，HJ-5），分析天平（AB204-N）。
海藻酸钠（生物级，阿拉丁试剂（上海）有限公司），牛胰脂肪酶（13-35 units/mg），橄榄油（分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司），聚乙烯醇（分
析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司），其余试剂均为分析纯。
1.2 固定化脂肪酶的制备
将海藻酸钠加热溶解，使海藻酸钠最终浓度为1.5% (w/v)，冷却后使海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，用蠕动泵滴入3.0% (w/v)的CaCl2溶液中，固定化一定时间后，滤出颗粒，用0.9%(w/v)生理盐水洗净后，浸在相同浓度的生理盐水中备用。
1.3 固定化脂肪酶活性的检测
取0.5 g固定化脂肪酶加到2 ml底物（按比例橄榄油∶聚乙烯醇∶缓冲液 = 1∶3∶5）中，于30 ℃下，水浴恒温振荡器中反应30 min。反应结束后，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，酚酞作为指示剂。酶活定义：在反应条件下，每分钟水解形成1μmo1脂肪酸所需酶量为1个酶活力单位(U)。
2 结果与分析
2.1海藻酸钠浓度对酶活的影响
海藻酸钠的浓度会影响固定化酶的机械强度以及物质的在颗粒内部的扩散，进而影响催化剂的活性。如图1所示，当海藻酸钠浓度为1.5％时，固定化酶的活力最大，所以选择海藻酸钠最适浓度为1.5％。
2.2 CaCl2浓度对酶活的影响
将1.5%海藻酸钠溶液与酶液混合后用蠕动泵分别滴入1，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0% (w/v)浓度的CaCl2溶液中，固定化1小时后，滤出颗粒，用生理盐水洗净，测定固定化酶的活性，结果如图2所示。当CaCl2浓度为3％时，固定化酶活性最高。
2.3 固定化时间的考察
将1.5% 海藻酸钠溶液与酶液混合后用蠕动泵滴入3%的CaCl2溶液中，分别固定化0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后，滤出颗粒，用生理盐水洗净，测定固定化酶的活性。结果如图3所示。有图可知，开始固定化时，固定化酶的活性呈升高趋势，到1 h时固定化酶活达到最大；随着固定化时间延长，固定化酶的活性又逐渐降低，这可能是因为随着固定化时间延长，海藻酸钠中的Na+逐渐被Ca2+替换，高分子结构致密，底物扩散阻力增加。所以固定化最佳时间为1 h。
2.4 固定化酶批次稳定性考察
将每一批次固定化脂肪酶反应后用蒸馏水润洗，然后继续进行下一批实验，测定每一批次的固定化酶酶活。由图4可知，在前四批反应过程中，固定化酶的酶活保持稳定性，第五批之后，酶活有了明显的下降，到第7批，酶活下降为零，这可能是由于固定化颗粒崩解所致。
3 结论
本文采用直接包埋法制备了海藻酸钠固定化脂肪酶，对固定化条件进行了优化，得到了催化活性较高、稳定性较好的固定化脂肪酶。
参考文献
[1]林繁华，张庆庆，汤斌等。聚丙烯-TiO2/CA复合膜固定化脂肪酶最佳条件的研究[J]。食品工业科技，2007
[2]王英，周剑忠，黄开红等。固定化脂肪酶催化活性影响因素的改变对生物柴油转化率的影响盯[J]。油脂工程技术，2007
[3]魏靖明，张志斌，冯华林等．海藻酸钠作为药物载体材料的研究进展[J]．化工新型材料，2007
