※生物工程食品科学2007, Vol. 28, No. 01209
玉米萌发过程中蛋白酶的活力和
蛋白质含量的研究
韩春然
（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 １５００７６）
摘 要：本文研究了玉米萌发过程中各种因素对其中所含蛋白酶活力的影响，并研究了获得最高蛋白酶活力度最佳萌发条件，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳确定了玉米萌发后可溶性蛋白的分子量。结果表明，水分含量、温度、光照以及赤霉素等因素对玉米蛋白酶活力均有影响，在水分３５％、温度３０℃、赤霉素３０ｍｇ／Ｌ和自然光照条件下萌发，玉米的蛋白酶活力最高；在萌发６ｄ后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱中出现了２０ｋＤ以下的两条明显谱带，ｂ带分子量测定结果为１９．２ｋＤ，ｃ带分子量测定结果为１８．２ｋＤ。关键词：玉米；萌发；蛋白酶；分子量
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｃｏｒｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ＨＡＮ Ｃｈｕｎ－ｒａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈａｒｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ， Ｈａｒｂｉｎ １５００７６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ ｃｏｒｎ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｃｏｒｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄｂｙ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ａｃｉｄ （ＧＡ）． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｏｎ ｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ３５％， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０℃， ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ａｃｉｄ ３０ｍｇ／Ｌ， ｎａｔｕｒａｌ ｌｉｇｈｔ； ａｆｔｅｒ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ６ｄａｙｓ， ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｗｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ２０ｋＤ， ｔｈｅ ｃｏｌｅｃｕｌａｒｅ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｂａｎｄ ｂａｎｄ ｃｗａｓ １９．２ｋＤ ａｎｄ １８．２ｋＤ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｒｎ；ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ
中图分类号：ＴＳ２０１．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０１－０２０９－０４
我国是世界上玉米生产第二大国，占世界总产的２０．６８％［１］。具有活力的玉米种子经休眠后熟期，给与必
需的外界条件（温度、水分、光照和养料），种子就可进入萌发阶段，种子的萌发是一个静态到动态的转变过程，在这个过程中，为了满足生长的需要，酶的活力显著增强，我们的前期研究表明，玉米萌发过程中，淀粉酶和蛋白酶的活性发生了显著变化，与未萌发时差别很大。蛋白酶在细胞生命活动中具有非常重要的意义，它的生理功能包括蛋白质水解和加工两个方面，它对体内蛋白质的周转、异常蛋白的降解、酶的活化、细胞骨架蛋白的修饰和多肽激素的加工等都起着极为重要的作用［２］。目前我国关于玉米种子萌发的研究多集中在种子和种子生理方面，而应用于食品开发则鲜有报道。本文研究玉米种子萌发过程中蛋白酶活性的影响因
收稿日期：２００５－１１－２０
基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（Ｃ２００４－１６）
素、蛋白酶的最佳提取条件，玉米萌发后可溶性蛋白的变化情况。旨在对玉米进行生物转化，增加其附加值，为进一步研究萌发玉米淀粉的性质及以其为原料进行功能性食品的开发奠定理论基础。１１．１
材料与方法仪器与设备
３０２Ａ型调温调湿箱 上海实验仪器厂；ＦＷ８０型微型高速万能试样粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；ＴＧＬ－１６型高速台式离心机 上海医疗器械六厂；ＺＹ５０００电泳仪 北京市君意机电技术公司。１．２
材料
玉米原料（黑３０１） 黑龙江省农科院玉米研究所；三氯乙酸（ＴＣＡ）、干酪素、福林试剂（自配）、Ｌ－酪氨
作者简介：韩春然（１９７０－），女，副教授，研究方向为食品基础原料开发。210 2007, Vol. 28, No. 01
酸、蛋白质标准样品，以上试剂均为分析纯。
食品科学２０蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）１５１０５０对照
※生物工程
１５％２５％３５％４５％
１．３１．３．１
方法
萌发过程中蛋白酶活力的变化
玉米萌发的基础条件为水分３０％，温度３０℃，自然光照，赤霉素添加量２０ｍｇ／Ｌ。改变其中的一个因素，其它条件不变，对玉米进行萌发，测定蛋白酶活力变化的情况。
（１）水分：１５％、２５％、３５％、４５％；（２）温度：１０、２０、３０、４０℃；（３）光照条件：自然光照、白光和黑暗；（４）赤霉素添加量：１、５、１０、３０、５０、１００、２００ｍｇ／Ｌ。１．３．２
最佳萌发条件的确定
以四因素三水平进行萌发培养，采用Ｌ９（３４）做正交
２４时间（ｄ）
６８
图１ 水分含量对萌发玉米蛋白酶活力的影响
Fig.1 Effect of moisture content on the proteinase activity of
corn during germination
力达到最高１５Ｕ／ｍｌ，６ｄ以后降低明显。而水分含量过多或过少时，蛋白酶活力均增加不多。２．１．２
温度对蛋白酶活力的影响
８蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）６４２０
对照１
１０℃２０℃３０℃４０℃
试验，确定玉米萌发中蛋白酶活力最高的条件。正交表头设计见表１。１．３．３
可溶性蛋白质分子量的测定
表１ 因素水平表L9(34)
Table 1 Factors and levels table L9(34)
水平１２３
因素
Ａ水分（％）
２５３５４５
Ｂ温度（℃）
２０３０４０
Ｃ光照黑暗白光自然光
Ｄ赤霉素（ｍｇ／Ｌ）
３０５０１００
２３４时间（ｄ）
５６７８
１．３．３．１玉米淀粉可溶性蛋白的提取
将自制的萌发６ｄ的玉米粉以石油醚脱净脂肪，将玉米淀粉置于去离子水中，控制工艺条件为：ｐＨ９．０，水料比１：１０，时间２ｈ，室温，３０００ｒ／ｍｉｎ下离心２０ｍｉｎ，取上清液，再经酸沉，离心，水洗，调ｐＨ７．０，冷冻，干燥，制得可溶性蛋白［３］。
１．３．３．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳
将制得的可溶性蛋白粉以２％的ＳＤＳ溶液溶解，加入５％（Ｖ／Ｖ）的巯基乙醇，煮沸３ｍｉｎ，冷却至室温，加入１０％（Ｖ／Ｖ）甘油和０．０１％（Ｖ／Ｖ）溴酚蓝溶液，进行电泳。
染色液：含０．２％（Ｗ／Ｖ）考马斯亮蓝Ｒ－２５０、４５％（Ｗ／Ｖ）的乙醇或甲醇和１０％（Ｗ／Ｖ）乙酸；脱色液：含７．５％乙酸和５％甲醇。１．３．４
蛋白酶测定方法采用Ｆｏｌｉｎ－酚法［４］。２２．１２．１．１
结果与分析
萌发过程中蛋白酶活力的变化情况水分对蛋白酶活力的影响
图２ 温度对萌发玉米蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effect of temperature on the proteinase activity of corn
during germination
由图２可以看出，各温度下，蛋白酶活力随着萌发时间的延长先上升，后下降，在３０℃萌发条件下，蛋白酶活力增加高于其它温度。２．１．３
光照对蛋白酶活力的影响
１５
黑暗
蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）正常
１０
白光
５
０对照１
２
３
４时间（ｄ）
图３ 光照对萌发玉米淀粉酶活力的影响
Fig.3 Effect on light on proteinase activity of corn during
germination
５
６
７
８
由图１可以看出，在不同的水分下进行萌发，蛋白酶活力增加不同，当水分为３５％时，萌发第４ｄ时活
由图３可看出，在不同的光照情况下，淀粉酶
※生物工程食品科学2007, Vol. 28, No. 01
表２ 萌发玉米蛋白酶最佳条件正交试验结果
211
活力不同。在自然光下，玉米种子受“光周期”现象的影响较其它光照效果好。白光可使种皮的通透性增强，提高种子中一些与生理活性相关的光敏素的含量，同时需要某些光化学过程以消除短日照下形成的萌发抑制剂，以及提高生长素含量。而黑暗下萌发时这些作用则相对要小一些。２．１．４
赤霉素添加量对蛋白酶活力的影响
１ｍｇ／Ｌ
１５蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）３０ｍｇ／Ｌ２００ｍｇ／Ｌ
１０
５ｍｇ／Ｌ５０ｍｇ／Ｌ
１０ｍｇ／Ｌ１００ｍｇ／Ｌ
Table 2 Othoganal test results of the optimum conditions of
proteinase in germinated corn
水分（％）１２３４５６７８９Ｋ１Ｋ２Ｋ３极差
１（２５）１１２（３５）２２３（４５）３３１０．６２７１３．４３３１２．０１７２．８０６
温度（℃）１（２０）２（３０）３（４０）１２３１２３１１．３６３１３．３４３１１．３７０１．９８０
光照１（暗光）２（白光）３（自然光）
２３１３１２１２．３５０１１．６９３１２．０３３０．６５７
赤霉素（ｍｇ／Ｌ）
１（３０）２（５０）３（１００）３１２２３１１２．４５７１１．７０３１１．９１７０．７５４
蛋白酶力（Ｕ／ｍｌ）
１０．７２１１．２９９．８７１２．３３１５．１９１２．７８１１．０４１３．５５１１．４６
５
０对照１
２
３
４时间（ｄ）
图４ 赤霉素对萌发玉米淀粉酶活力的影响
Fig.4 Effect of GA on proteinase activity of corn during
germination
５
６
７
８
以６ｄ为萌发最终时间，制得的可溶性蛋白质经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳，染色后可检测到低分子量的谱带３条，如图５所示。
０
９４ｋＤ６７ｋＤ４３ｋＤ３０ｋＤ
ａｂｃ
图５ 萌发６ｄ的玉米淀粉电泳图谱
Fig.5 Electrophoretogram of corn after germination for 6 days
表３ 萌发玉米粉中可溶性蛋白分子量的确定
Table 3 Determination of molecular weight of soluble protein of
germinated corn
样品号对照样萌发第１ｄ萌发第２ｄ萌发第３ｄ萌发第４ｄ萌发第５ｄ萌发第６ｄ
样品谱带 标准分子量谱带相对位置（ｍｍ）
６１．６０－６５．７１－６８．０９－－
ｃｂａ
１２３４５６
从图４中可看出，外加赤霉素含量在３０ｍｇ／Ｌ，第６ｄ时蛋白酶活力１６．４Ｕ／ｍｌ，萌发效果较好，而高
剂量组反而抑制了蛋白酶的活性。这可能与赤霉素的生理作用密切相关，即高剂量的赤霉素不但开始抑制吲哚乙酸和它的前体色氨酸的形成，又能促进吲哚乙酸氧化酶的活性，使吲哚乙酸含量减小，抑制了萌发。
蛋白酶分布于糊粉层中，在细胞内的活动内的活动区域相对小一些，因此其作用于底物而表现出的活力整体上比淀粉酶弱。在玉米种子的萌发过程中，活力较强的水解酶首先作用于相对应的细胞机体，破坏了溶菌体膜，同时会对其它的酶进行破坏。因而引起原生质的机能紊乱和结构瓦解。随时间的延长，蛋白酶由于作用的底物蛋白质相对少一些，因而其活力会受到一定的影响，而长时间的水分浸泡会使其营养物质外渗，导致蛋白酶的活力下降。２．２
最佳萌发条件的确定
以Ｌ９（３４）正交表进行试验，萌发６ｄ，并对结果进行
１７．５ｋＤ
相对位置（ｍｍ）
５．９９１４．１６２０．５４４６．２２６９．８７－－
分子量（ｋＤ）
９４６７４３３０１７．５－－
注：ａ对照样品蛋白质谱带；ｂ、ｃ萌发后小分子量蛋白谱带。
极差分析，确定最佳萌发条件，结果见表２。
由正交试验结果可看出，各因素对萌发玉米蛋白酶的影程顺序为Ａ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ，最优组合为Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ１，即水分３５％、温度３０℃、赤霉素３０ｍｇ／Ｌ和自然光照条件下蛋白酶活力可达１５．１９Ｕ／ｍｌ。２．３２．３．１
可溶性蛋白质分子量的确定电泳图谱
由图５可以看出，从萌发第２、第３ｄ时，在大约１９ｋＤ处开始出现蛋白带（图中ｃ），第４至第６ｄ时，在２０ｋＤ处明显出现蛋白带（图中ｂ）；而可溶性蛋白（ａ带）数量明显增加。总之，萌发６ｄ后，２０ｋＤ以下可溶性蛋白质含量增加。经过与标准蛋白质相比较（表３），得出ｂ带分子量测定结果为１９．２ｋＤ，ｃ带分子量测定结果为
212 2007, Vol. 28, No. 01
食品科学※生物工程
一株海藻糖合成酶产生菌的筛选及初步鉴定
尚宏丽，陈红漫＊
（沈阳农业大学生物技术学院，辽宁 沈阳 １１０１６１）
摘 要：由长白山温泉附近土壤筛选得到菌株编号ＳＨ－１１０菌，分别利用ＴＬＣ方法、ＨＰＬＣ法来确定该菌株所产的胞内酶能够利用麦芽糖作为底物来合成海藻糖，确定该酶为海藻糖合成酶，通过对该菌生物学特征鉴定，生理生化特征分析，初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）关键词：海藻糖合成酶；筛选；鉴定
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ —— Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＳＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｌｉ，ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ－ｍａｎ＊
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｎａｍｅｄ ＳＨ－１１０ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｈｏｔ ｓｐｒｉｎｇｓ ｏｆ Ｃｈａｎｇｂａｉｍｏｕｎｔａｉｎ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｄｏｐｔｅｄ ＴＬＣ， ＤＮＳ， ＨＰＬＣ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉ－ｃａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｉｔ ｉｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｂｅ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
中图分类号：Ｑ９３９．１２４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０１－０２１２－０４
海藻糖（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）是一种非还原性二糖，在许多可食用动植物及微生物细胞内广泛存在。海藻糖在高温、
高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能稳定细胞膜和蛋白质的结构，有效保护细胞膜和蛋白质的结构，有效地保护细胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生物体的生命过程和生物特征［１］。海藻糖在分子生物学、医学、轻工、农业等领域，特别是在食品工业有广泛的应用前景。海藻糖具有在食品加工过程中
收稿日期：２００５－０８－２５ ＊通讯作者
能防止淀粉老化、蛋白质变性、稳定组织细胞结构、抑制脂肪酸分解及补充能量的营养性等功能特性，对于
新型食品的开发，减少化学合成添加剂、保鲜剂的使用，提高食品安全性等方面意义深远。
酶法转化海藻糖一直是工业生产海藻糖的主要途径。海藻糖合成酶是近年发现的一种新酶，可通过转糖基作用直接将麦芽糖转化为海藻糖，在工业酶法生产海藻糖中最具优势。据报道该酶存在于脂肪杆菌、恶
作者简介：尚宏丽（１９７７－），女，硕士研究生，主要从事食品酶工程的研究。
１８．２ｋＤ。可见萌发后玉米可溶性蛋白质含量增加，大分子量蛋白质开始降解，从营养角度讲，增加了功能特性，有助于消化吸收。３
结 论
玉米萌发过程中，水分、温度、光照条件及赤霉素对其中蛋白酶活力都有影响，在水分３５％、温度３０℃、赤霉素３０ｍｇ／Ｌ和自然光照条件下萌发，玉米的蛋白酶活力达到最高（１５．１９Ｕ／ｍｌ）；萌发后玉米淀粉在蛋白酶的作用下，出现了２０ｋＤ以下的两条明显谱带，ｂ带分子量测定结果为１９．２ｋＤ，ｃ带分子量测定结果为
１８．２ｋＤ。可见萌发后玉米可溶性蛋白质含量增加，大分子量蛋白质开始降解。
参考文献：
［１］［２］
尤新． 玉米深加工技术［Ｍ］． 北京： 中国轻工业出版社， １９９９： ２１１－２１３．
孙谷畴， 林植芳， 林桂珠， 等． 湖北光周期敏感核不育水稻农垦５８Ｓ幼穗和花药发育期的蛋白酶活性变化［Ｊ］． 热带亚热带植物学报， １９９７，５（２）： ６１－６７．
［３］［４］
陈季旺， 姚惠源， 张小勇， 等． 米糠可溶性蛋白的提取工艺和特性研究［Ｊ］． 中国油脂， ２００３（２）： ４６－５０．
朱广廉， 钟诲文， 张爱琴． 植物生理学实验［Ｍ］． 北京： 北京大学出版社， １９９０： １７５－１７８．
