基因表达应用示例
通过实时荧光定量PCR技术实现对miRNA靶向物mRNAs的相对定量分析
1 导言
小RNA（miRNAs）是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA，它们是许多基础的细胞过程中基因表达的主要调节因子，这些过程包括细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡等。miRNA在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说，miRNA通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的。然而，在靶向mRNA降解水平上的基因表达的已有报道。因此，有证据显示miRNA能够通过RNA降解来实现对细胞内mRNA浓度的直接，而且也会通过靶向作用于蛋白质级联来mRNA水平，这些蛋白质级联能够下游转录或在转录后对mRNA水平进行。
在当前的研究中，我们重点关注miRNA hsa（人）miR-21，研究发现在乳腺癌和其他肿瘤中miR-21水平上调。更进一步的研究发现，miR-21在细胞凋亡和细胞生长过程中也发挥着功能性作用。为了进一步对miR-21进行研究，我们研究了miR-21的水平对三个假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）mRNA表达的影响（见图1）。
2 材料和方法
细胞培养 qRT-PCR
DMEM培养基中补充1%的L-谷氨酰基因表达分析 胺，1%的盘尼西林/链霉素，10%的FBS，在在384孔板上11ul/孔的总反应体积中，+37℃ 5%CO2条件下培养HeLa细胞。用使用荧光Universal ProbeLibrary（UPL）探针miRNA 21 miRIDIAN类似物，miRNA 类似（罗氏公司）和ABI 7900HT 实时仪器（美物miRIDIAN对照，miRNA 21 mi RIDIAN抑国应用生物系统公司）以及2X FastStart 制剂和miRNA miRIDIAN抑制剂对照siRNAUniversal Probe Master （Rox）PCR试剂（罗（dhar-macon都为50nM），以及氏公司）进行定量RT-PCR。每次反应的 X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），cDNA/RNA浓度为10ng。ABI 7900HT实时按照生产商的方案进行转染。 仪器（美国应用生物系统公司）的PCR条件 如下：+95℃下变性15分钟，+95℃下扩增RNA提取与逆转录 15秒，最后在+60℃下延伸60秒。 在转染之后两天，使用High Pure RNA miRNA定量 Isolation Kit（罗氏公司），按照生产商的建议使用LightCycler® 480实时荧光PCR仪（罗从HeLa细胞中提取总RNA（每个类似物氏公司）， 在384孔板的模式下，设定反应miRNA三个生物学复制）。同时，使用High 体积为20ul，以1:10梯度稀释cDNA，在Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司），按照miRCURY LNA SYBR Green master mix，使用说明书上的指导，提取包含小分子量miRCURY LNA内源性对照SNORD44和RNA在内的总RNA（两个生物学重复）（见miR-21的LNA PCR引物（Exiqon）的共同图2）。按照生产商的指导，使用Transcriptor 作用下进行miRNA qRT-PCR. LightCycler® First Strand cDNA Synthesis Kit（罗氏公司）480仪的PCR条件如下： 95℃变性10分钟， 和oligo（dT）18与随机六聚体引物的混合物，95℃变性10秒，60℃延伸20秒，反应设40按照每次反应500到1000ng总RNA的量进个循环。使用△△Ct方法（Livak 和行第一链cDNA的合成。用miRCURY LNA Schmittgen，2001年），用HPRT1和GAPDHFirst-strand cDNA Kit（Exiqon）进行miRNA 作为参考（管家基因）基因，来反映假定的第一链cDNA的合成，每次反应使用4ng含靶向基因表达水平上的成倍变化。对于has 有小RNA在内的总RNA。 miR-21，则用非靶向合成类似物-和抑制剂
-miRIDIAN作为miRNA转染HeLa细胞的实验对照。
培养HeLa细胞
图1： 利用假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）的表达水平分析从而对has miR21进行分析的工作流程。
用miRNA miRIDIAN类似物和miRNA类似物miRIDIAN对照，以及miRNA 21miRIDIAN抑制剂和miRNA miRIDIAN抑制剂对照siRNA转染HeLa细胞。
提取miRNA 提取总RNA
qRT-PCR-miRNA定量 qRT-PCR-基因表达分析
图2：用指定试剂（miRIDIAN miRNA类似物或miRIDIAN miRNA抑制剂）转染HeLa细胞后，用Agilent生物分析仪对来自不同细胞集群的小分子量RNA进行凝胶电泳。
3 结果和讨论
为了分析miR-21水平升高对靶向基因（PDCE4，PTEN和TLR2）的mRNA水平的影响，我们使用UPL通用探针库探针（罗氏公司）和ABI 7900HT实时PCR仪（美国应用生物系统公司）对已经报道的能够被miR-21的一些mRNA的丰度进行了定量测定。使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），用miR-21的类似物和抑制剂对HeLa细胞进行转染，并分别设置（miRNA 21 miRIDIAN类似物对照，miRNA miRIDIAN类似物对照，miRNA 21抑制剂和miRNA抑制剂对照siRNAs）。miRIDIAN miRNA类似物是一种合成的双链结构，能够代表对靶向mRNAs进行的成熟miRNAs，与内源性miRNAs类似。与之相反，miRIDIAN miRNA抑制剂是一种不可水解的成熟miRNA的反向互补单链，在转染细胞之后能够降低内源性miRNAs的活性。这极有可能是由于抑制剂与成熟miRNA之间进行不可逆结合造成的（Meister, Landthaler等，2004）。 我们在LightCycler® 480（罗氏公司）上进行qRT-PCR，对miR-21的miRIDIAN类似物和抑制剂对成熟miR-21水平的影响进行了定量测定。使用High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司）提取miRNA，用qRT-PCR与miRCURY LNA进行定量检测，并用小分子量非编码核仁RNA SNORD44进行校准。与用miRIDIAN类似物处理的对照细胞相比较，用50nM miR-21的miRIDIAN类似物转染细胞后，HeLa细胞中miR-21的浓度上升了7.3倍（见图3）。与之相反，用50nM miR-21的miRIDIAN抑制剂转染HeLa细胞后，miR-21水平下降了77%（见图3）。这表明，X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司）是一种非常好的转染工具，能够有效地将miRIDIAN类似物和miRIDIAN抑制剂转染到目标细胞中。而且我们还发现，High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司）能够有效地提取miRNA，并用于之后miRNA浓度的分析。
在使用miRIDIAN类似物和抑制剂上调和下调细胞内miR-21浓度之后，我们对miR-21公认的靶向mRNAs（PDCD4， PTEN 和TLR2）的表达水平进行了研究。在用miR-21的类似物和抑制剂以及各自的对照物感染HeLa细胞两天之后，用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司）提取总RNA。在ABI 7900HT（美国应用生物系统公司）上使用qRT-PCR和UPL通用探针库探针对mRNA水平进行定量测定，并与对照基因（管家基因）HPRT1和GAPDH正常的基因表达水平进行比较。我们发现，与对照组相比，miR-21的过度表达导致PDCD4（编码人致瘤性转化抑制物）的mRNA水平显著下降了29%（见图4）。最近的研究发现，mi-R-21过度表达能够在蛋白质水平和mRNA水平上对PDCD4基因造成影响（Frankel，Christoffersen等人，JBC，2008，283），该实验的结果进一步证实了这一发现。 与之相反，在PTEN 的mRNA（编码人同源性磷酸酶-张力蛋白）水平上没有观察到miR-21的影响。在上调或下调miR-21水平之后都是这种情况（见图5）。最近的研究发现miR-21能够通过影响翻译过程而在蛋白质水平上对PTEN产生影响，而PTEN mRNA水平则不发生变化（Wickramasinghe 等人，2009，NAR）。我们的研究与这一发现相符。有意思的是，与抑制剂转染对照细胞相比，在用miR-21抑制剂转染细胞之后，TLR2（编码toll样受体2）mRNA水平显著下降了57%（见图6）。miR-21和TLR2都在细胞凋亡过程中发挥作用，TLR2可能是miR-21抗细胞凋亡活动的重要介质。TLR2是miR-21活性的直接还是间接靶向基因尚不清楚，仍有待研究。
表达倍数变化 miR21抑制剂 miR21类似物
图3：miR-21表达的高水平变化。图中显示的是在miR-21抑制（黄色条）或过表达（蓝色条）之后的miR-21水平，分别与各自的抑制剂和类似物对照转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。
表达倍数变化 miR21抑制剂 miR21类似物
图5：miR21水平调节对PTEN基因表达的影响。当细胞内miRNA-21浓度发生变化时，PTEN RNA的mRNA水平并不发生变化。图中显示的是分别在miRNA-21过表达（黄色条）和miRNA-21抑制（蓝色条）之后PTEN基因mRNA的表达水平，分别与各自对照的抑制剂和类似物转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。
表达倍数变化
miR21抑制剂 miR21类似物
图4：miR21对PDCD4基因表达的。mRNA-21过表达（蓝色条）导致PDCD4 mRNA水平下降，而miRNA-21下调（黄色条）并不影响PDCD4的mRNA水平，分别与各自的抑制剂和类似物对照转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。
表达倍数变化
miR21抑制剂 miR21类似物
图6：miR-21水平调节对TLR2基因表达的影响。miRNA-21抑制（黄色条）并不会影响TLR2 mRNA水平，而miR-21过表达（蓝色条）会导致TLR2 mRNA水平下降，分别与各自对照的抑制剂和类似物转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。
4 结论
在该研究中，我们分析了hsa miR-21对为了对假定目标基因进行基因表达分三个公认的靶向基因（PDCD4，PTEN 和析，我们在工作流程中使用High Pure RNA TLR2）在mRNA表达水平上的影响。人Isolation Kit（罗氏公司）进行RNA提取，使miR-21应答通过外源性miRNA miRIDIAN用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 类似物和抑制剂（Dharmacon）进行，使Kit（罗氏公司）进行逆转录，并用通用探针用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公库探针UPL和FastStart Universal Probe 司）能够轻松实现类似物与抑制剂向HeLaMaster（Rox）试剂（罗氏公司）和ABI 7900HT细胞的转染过程。 （美国应用生物系统公司）在细胞内
为了分析miR21水平，罗氏公司的High miRNA之后对mRNA水平进行定量测定。 Pure miRNA Isolation Kit为之后进行综上，该基因表达分析的工作流程程序qRT-PCR扩增提供了高质量的模板。该扩增易于建立，并且足够灵敏，能够检测到由一过程用miRCURY LNA First-strand cDNA试般miRNAs引起的mRNA水平的细微变化，剂盒，miRCURY LNA SYBR Green Master 适合相关miRNA表达研究的参考。 Mix，miRCURY LNA内源性对照SNORD44 和LNA miR-21 PCR引物（Exiqon），在LightCycler® 480实时荧光PCR仪（罗氏公司）上进行。
参考文献
1. Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001) 4. Wickramasinghe, N.S., Manavalan, T.T., Analysis of relative gene expression data using Dougherty, S.M., Riggs, K.A., Li, Y. and real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Klinge, C.M. (2009) Estradiol downregulates Delta C(T)) Method. Methods, 25, 402-408. miR-21 expression and increases miR-21 target 2. Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y. and gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Tuschl, T. (2004) Sequence-specific inhibition Nucleic Acids Res. of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA, 10, 544-550.
3. Frankel, L.B., Christoffersen, N.R.,
Jacobsen, A., Lindow, M., Krogh, A. and Lund, A.H. (2008) Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the
microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem, 283, 1026-1033.
X-TREMEGENE，LIGHTCYCLER，HIGH PURE和FASTSTART为罗氏公司商标。 ProbeLibrary和 LNA是丹麦Vedbaek Exiqon A/S公司的注册商标。 SYBR是分子探针有限公司的注册商标。 miRIDIAN是Dharmacon公司的商标。
其他商标或产品名称为其各自所有者的商标。
