重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

吴兴翰;陈敏;李硕

【摘 要】AHA2 protein anchors within the cytoplasm membrane of plant cell.In prokaryotic expression system,the protein can't be recombinant expressed.In Saccharomyces cerevisiae expression system,the procedures of AHA2 purification stay complex and expensive.The aha2 gene sequence of Arabidopsis thaliana,at a length of 2984bp,was inserted into vector pPICZα A.The constructed recombinant plasmid pPICZα A-aha2 was linearized and transfected to x33 cells by electroporation.X33 cells was harvested after 72 hours induced by 0.5％ methyl alcohol.Refrigeration-rubbing the cells,collected the supernatant.Purified the interest protein by affinity chromatography and molecular sieve chromatography.Various components were obtained and determined for protein content by SDS-PAGE.The SDSPAGE showed that the AHA2 protein was located in lane with relative molecular masses of 97kD.So the AHA2 protein of

Arabidopsis thaliana was successfully expressed and purified in PiChia X33 expression system.%AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZα A中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5％甲醇诱导表达72 h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.

【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2017(054)005 【总页数】6页(P1119-1124)

【关键词】aha2;基因克隆;重组蛋白表达;蛋白纯化 【作 者】吴兴翰;陈敏;李硕

【作者单位】四川大学生命科学学院,成都6100;成都市第三人民医院,成都610031;四川大学生命科学学院,成都6100 【正文语种】中 文 【中图分类】Q78

很多生命活动都与膜蛋白有直接关系，膜蛋白在能量转换、信号转导和物质运输等重要生命过程中都发挥着至关重要的作用.植物质膜上的AHA2蛋白作为质子泵，在植物质膜两侧形成跨膜质子驱动力，用于ATP的形成[1].与此同时，它还参与次级离子或溶质的传递，并且控制着植物生长发育的诸多过程，近期还有研究表明AHA2与植物根系结构应对氮源供给有重要联系[2].

植物质膜上的AHA2蛋白属于P型ATP酶[3]，在转运质子的过程中涉及磷酸化和去磷酸化[4].AHA2蛋白在组成上包含一个α亚基和一个β亚基，具有一个10次跨膜螺旋，氨基端和羧基端都位于细胞质一侧.细胞质内最大的肽链环中包含有催化过程中磷酸化的天冬氨酸残基以及与ATP的结合区[5].

植物质膜上的AHA2蛋白在植物的抗盐性[6]、气孔的开闭[7, 8]、渗透压的调节，细胞内pH值的调节[9]及植物根系的发育、植物对氮源的吸收[2]等过程中可以起到十分重要和广泛的作用.它是植物适应不同环境的生理元件，广泛的参与植物细

胞中多条信号通路[10]，通过自身活性的调节，使植物得以适应环境和发育过程中的变化.

因为AHA2蛋白在植物的生长分化，抗逆，免疫[11, 12]，代谢上具有极其重要的作用.一直以来人们对该蛋白的研究不曾停止.由于该蛋白现有的表达提纯方法流程复杂，成本高昂，一般实验室难以实施[5, 13]，这使得针对于AHA2蛋白的体外实验受到，严重制约了对AHA2蛋白功能的研究.本文克隆了aha2基因；并利用毕赤酵母(PiChia)对AHA2蛋白加以表达，构建了AHA2蛋白的表达载体；采用了新的简单易行的方法对目的蛋白进行了提纯；经过浓缩、富集和分子筛层析，获得了与14-3-3结合的目的蛋白，14-3-3作为分子伴侣，可以进一步激活AHA2的活性[14, 15]为后续研究提供便利的同时，也为其他科研工作者提供了借鉴. 2.1 材 料

2.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌为DH5α菌株，PiChia酵母表达菌株X33，pPICZα A酵母表达质粒(实验室改造，去除了多克隆位点，保留了NdeⅠ与XhoⅠ两个酶切位点)，均为实验室保存.

2.1.2 工具酶和试剂 DNA聚合酶pfu，性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ、SacⅠ为NEB公司(英国)产品，其余生化试剂购于Sigma公司(美国)，镍柱柱材购于QIANGEN公司(德国)，DDM(十二烷基-β-D-麦芽糖苷，n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)购自Anatrace公司(英国). 2.2 方 法

2.2.1 序列分析 用Snapgen软件进行多序列比对，用HMMTOP软件进行跨膜结构域的预测，用DNAman软件进行了序列同源性分析.

2.2.2 aha2的PCR扩增 根据aha2 cDNA序列，设计了aha2的引物，上游引物序列为5′-GGGAATTCCATATGTCGAGTCTCGAAGATATC-3′，下游引物序列为

5′-CCGCTCGAGCACAGTGTAGTGACTGGG-3′.反应以拟南芥根系cDNA为模板，在上下游分别采用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ作为酶切位点，使用高保真DNA聚合酶进行PCR反应，反应的条件为：95℃ 5min；95℃ 15s，54℃ 15s，72℃ 2.5min，进行30个循环；72℃ 5min； 4℃储存PCR产物.扩增的产物为AHA2蛋白的全长编码序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收后备用.

2.2.3 毕赤酵母表达载体的构建 将2.2.2所获得的PCR产物进行双酶切，所使用的酶为NdeⅠ和XhoⅠ，将酶切产物克隆到相同酶切后的pPICZα A酵母表达载体中.

2.2.4 毕赤酵母表达载体的线性化 酵母表达载体pPICZα A-aha2先转化大肠杆菌，经振荡培养后，提取质粒，质粒纯化后用SacⅠ完全酶切，使质粒线性化，线性化的质粒经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶，回收后备用.

2.2.5 酵母的转化与抗性筛选 将100μL感受态细胞X33与20μg线性化的DNA轻柔的混合；将混合后的感受态细胞转移至洁净的电转杯中，置于冰上5 min以上； 选择真菌转化，进行电转；加入1mL 1mM的山梨醇，将细胞与DNA的混合液转移至1mL管中，在30℃条件下孵育1 h；14000r/min 30s将混合液离心，弃去上清；用1 mL预热后的YPD培养基将沉淀悬起，转移到50mL管中，30℃ 220r/min孵育2 h.

将孵育好的酵母细胞涂抹在具有100μg/mL Zeocin的YPD培养基上进行初步抗性筛选；选择生长速度快的菌落转接到具有250μg/mL Zeocin的YPD培养基上进行再一次抗性筛选.

2.2.6 AHA2蛋白在毕赤酵母中的小量表达测试 挑取YPD培养基上筛选出的单克隆转接到5mL BMGY培养基中，30℃ 220r/min培养16个小时，使培养液OD600达到4～6；抽取0.5mL过夜培养液用双蒸水稀释至OD600低于2.5，计算每个培养样品的稀释倍率；将剩余的培养液离心，用双蒸馏水冲洗3次，根据

计算得出的稀释倍率，用BMMY培养基稀释至OD为20；抽取以上稀释后的培养基各5mL，确保样品中菌体量一致，在30℃条件下进行蛋白表达培养；同时保存未经BMMY培养基诱导表达的酵母培养液各0.5mL作为阴性对照；之后每隔24 h取诱导表达酵母培养液0.5mL，另外在培养体系中补充0.5mL BMMY培养基，直至第72 h.

2.2.7 AHA2蛋白在毕赤酵母中表达的免疫印迹试验检测 将2.2.6中所保留的样品(0.5mL)离心，将沉淀用50μL含有蛋白酶抑制剂 PMSF的PBS缓冲液重悬；每个样品加入5μL Lyticase(5U/μL)，在37℃，30min条件下将酵母细胞壁消化；加入70μL 200mM NaOH溶液进一步消化10min；将样品反复冻融10次，确保细胞壁完全打开；加入150μL 2×Loading Buffer后样品进行蛋白免疫印迹试验检测.

2.2.8 诱导AHA2的大量表达 利用BMGY培养基对工程菌进行大量培养，在30℃、220r/min的条件下，酵母培养液的OD600值在18 h后会达到6～8；将工程菌的菌体在3800r/min 离心10min条件下离心，并用高温湿热灭菌后的4℃双蒸水将菌体清洗三次；将清洗过的菌体用BMMY培养基重悬至OD为2；在30℃ 250r/min的条件下继续培养工程菌72 h，使AHA2蛋白充分表达.

以3800r/min 离心10min收集工程菌，将菌体用双蒸水清洗三次，用PBS重悬，用液氮冷冻研磨机对重悬菌液进行研磨：13cps 10个循环；将研磨后的粉末置于四度冷室化开；13000r/min 4℃离心30min；将沉淀用含有2% DDM(十二烷基-β-D-麦芽糖苷，n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)的PBS缓冲液重悬，并用匀浆机充分打匀；将破碎菌体溶液置于4℃冷室，孵育2小时，使AHA2蛋白充分从细胞质膜上脱离下来；将该溶液13000 r/min 4℃离心30min，取上清抽滤后进行亲和层析提纯.

2.2.9 AHA2蛋白的亲和层析提纯 将2.2.8中超速离心的上清反复充填Ni-NTA亲

和柱柱材三遍，使蛋白和柱材充分混合.

每12 L培养基所培养出的酵母量需要用12mL的Ni-NTA亲和柱材.然后每2mL Ni-NTA亲和柱材加入三次10mL Wash Buffer(含25mM咪唑和0.2% DDM的PBS缓冲液)，从而将非特异性结合的杂蛋白除去.

最后每2mL柱材加入10mL Elution Buffer(含250mM咪唑和0.2% DDM的PBS缓冲液)，将目的膜蛋白从亲和柱材上洗脱下来.

2.2.10 蛋白的浓缩 将流出的洗脱液加入浓缩离心管中，在台式冷冻离心机中以4℃条件进行离心，最终浓缩体积视实验需求而定.使用Centricon®进行浓缩时离心力不应超过2500g，而使用Centriprep®进行浓缩时离心力不应超过1100g，否则将会造成浓缩膜的破裂.

2.2.11 蛋白的凝胶排阻色谱纯化 预先用SD200分子筛纯化缓冲液平衡

Superdex-200色谱柱，将2.2.10得到的浓缩液注射入色谱仪的进样器中，启动色谱仪，流速设定为0.5mL/min，限压不超过1.5MPa.

设定色谱仪的组分收集器，每0.5mL收集一个流出组分，收集范围为洗脱体积7.0mL至24.0mL.根据紫外吸收色谱图估计含有目的蛋白组分的位置，并用SDS-PAGE进行分析，选取含量最大、纯度最高的几个组分作为蛋白纯化的最终产品. 2.2.12 蛋白浓度的测定 根据Bio-Rad生产的Protein Assay试剂盒的操作说明操作：(1)染色剂稀释.将蛋白染色剂用超纯水稀释5倍，充分溶解后用0.44μm的滤膜过滤(可以室温保存两周).(2)配制牛血清白蛋白(BSA)标准品.将1mg/mL的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL，另加一组超纯水做负对照.(3)染色.向1.5mL染色剂中分别加入各浓度的BSA、超纯水和样品各30μL，摇匀，每管两个重复，室温放置5min.(4)用分光光度计测量600nm处吸光值，记录并绘制标准曲线确定样品浓度.

3.1 植物aha2基因的克隆

本研究基于植物aha2(NCBI序列号：NC_003075.7 )，设计了序列特异性引物.以拟南芥根系组织的cDNA为模板扩增植物aha2基因.如图1琼脂糖凝胶电泳所示，植物aha2基因扩增结果为2984bp，理论编码蛋白大小约为97kD. 经菌落PCR检验和测序，证明是正确的PCR扩增. 3.2 植物aha2基因表达载体的构建及诱导表达

本实验中将实验室改造过的pPICZα A质粒作为真核表达载体.我们将PCR产物及质粒纯化回收、双酶切(采用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切)、连接得到pPICZα A-aha2重组质粒.

将pPICZα A-aha2重组质粒用SacⅠ进行单酶切后，利用线性化质粒具有的同源臂将基因序列整合到毕赤酵母基因组中.经抗性筛选和特异引物PCR菌落筛选得到含有重组质粒的工程菌.用免疫印迹试验检测甲醇浓度梯度和时间梯度诱导效果，因为浓度过高的甲醇会对酵母产生毒害，故选择了0.1%、0.3%、0.5%的浓度进行测试(如图2).图2(A)、图2(B)、图2(C)分别检测到97kD的AHA2融合蛋白.该蛋白的最佳甲醇诱导浓度为0.5%，最佳诱导时间为72 h. 3.3 植物AHA2重组蛋白的纯化

用含有不同咪唑浓度的蛋白洗脱缓冲液(Wash Buffer)，浓度梯度洗脱杂蛋白，得到AHA2洗脱杂蛋白的最佳浓度均为25mM咪唑(如图3).经25mM咪唑浓度清洗杂蛋白后，用250mM咪唑洗脱目的蛋白，我们得到了粗提纯的蛋白样品(如图3).

将此蛋白质样品浓缩至2mL以内，我们发现蛋白浓缩液中主要存在两种蛋白，一种大小在97kD左右，与AHA2蛋白大小一致.一种大小在33kD左右，与已经报道的14-3-3大小一致(如图5)，14-3-3一直以来被认为是AHA2蛋白的分子伴侣，并可以进一步激活AHA2的转运活性.由于14-3-3的丰度不高，大小为目的蛋白三分之一，故在图4中没有检测到.将蛋白混合液注入Superdex 200凝胶排阻色

谱柱中，我们得到了纯度很高的AHA2蛋白，令人惊喜的是我们表达得到的蛋白为AHA2蛋白与分子伴侣14-3-3结合的高活性状态(如图4)，这种蛋白活性高，性质良好，为后期AHA2蛋白的功能研究提供了特别好的实验材料.

我们通过RT-PCR技术成功克隆到了aha2这个植物中极为重要的质子泵和ATP酶基因，并且创建了AHA2蛋白的PiChia表达纯化系统，这种纯化系统与已有的酿酒酵母表达纯化AHA2蛋白的系统相比，具有以下优势：1 因为AHA2蛋白在酵母中表达为异源表达的质膜蛋白，该蛋白的表达量极低，根据已有报道，在酿酒酵母表达体系，需要使用50kg发酵罐进行表达[13].本实验采用表达体系用摇瓶即可实现，十分经济、方便； 2 该表达体系只需90 h即可完成目的蛋白的表达，更为省时； 3 该表达体系所获得的目的蛋白为AHA2蛋白的高活性态，证明表达过程中修饰完善，对后期实验具有十分积极的影响.经SDS-PAGE检测， 重组AHA2蛋白被14-3-3蛋白激发的活性态纯度在90%以上，和14-3-3蛋白的结合比例约为1∶1～1∶2.人们对AHA2蛋白功能的研究还不是很全面，特别是由于高度提纯的AHA2蛋白较难获得，使相关体外实验的进行受到.使用PiChia酵母表达体系对该蛋白进行重组表达，为科研工作者提供了获得AHA2重组表达蛋白的又一有效方法.

4.1 植物AHA2蛋白的诱导表达

经检测AHA2蛋白的最佳甲醇诱导浓度为0.5%.在真核表达AHA2蛋白的过程中，我们做了大量的甲醇浓度梯度诱导，但诱导效果均不佳.经过总结分析后发现：0.5%的甲醇可以在不毒害酵母的情况下，表达最高产量的AHA2蛋白.工程菌中重组蛋白的表达量与培养基营养、生长温度、蛋白生产速率(包括不同的因素，如基因剂量、启动子活性、mRNA稳定性等)等因子有关.为了提高重组蛋白的表达水平，我们采用30℃，220r/min，1L体系培养工程菌，使用30℃，250r/min，1L体系诱导工程菌表达目的蛋白，经检测得到了目的蛋白.说明使用PiChia表达AHA2蛋

白这一分子量大且具有10次跨膜螺旋的异源目的蛋白是可能的. 4.2 植物AHA2重组蛋白的纯化

本实验选择了十分温和的非离子型去垢剂DDM对目的蛋白进行了有效的抽提，这是能使我们获得高活性态AHA2蛋白的关键.众所周知，酵母细胞壁的成分与大肠杆菌有很大不同，是否能将AHA2蛋白从PiChia酵母致密的细胞膜上抽提出来，关键在于DDM浓度的选择，经过不断实践，我们选择了2%的DDM作为抽提AHA2蛋白所使用的去垢剂浓度.

经过25mM咪唑浓度的Wash Buffer洗除杂蛋白，我们得到了纯度约为90%的蛋白样品(如图5).在蛋白纯化过程中，His标签可以特异的与NTA表面螯合的镍离子结合(His的侧链基团有咪唑基)；因此融合蛋白可以特异的结合到镍柱表面，而其它蛋白随溶液流出.当需要将目的蛋白洗脱时，加入高浓度的咪唑可以跟His标签竞争镍离子的结合位点，将融合蛋白洗脱.

本研究同时选择了凝胶排阻色谱法对AHA2蛋白进行了进一步提纯，这样我们提纯的目的蛋白可以应用到MST(微量热涌动法)、ITC(等温滴定量热法)和脂质体包裹转运等对目的蛋白具有较高纯度要求的实验中.我们采用全程4℃冷室操作，并在液氮冷冻研磨时加PMSF抑制蛋白酶活性.表达的蛋白经过SDS-PAGE检测跟预期大小一致.

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