高效液相色谱法测定多类食品中胭脂虫红的含量

中国食品添加剂

高效液相色谱法测定多类食品中胭脂虫红的含量

董超先，张晨曦，邹幼成，李芸，吴琛，区振豪

（国家营养食品质量监督检验中心，深圳市计量质量检测研究院，深圳 518110）

摘 要：建立了高效液相色谱法测定多类食品中胭脂虫红的含量。试样用盐酸于水浴酸化后，用甲醇溶液提取，考察了不同用量的溶剂对提取结果的影响，选择用2mol/L盐酸溶液10.0mL和甲醇15.0mL作为提取液。提取液经聚酰胺固相萃取小柱净化后，用高效液相色谱（带二极管阵列检测器）进行检测，外标法定量。样品检测采用TC-C18（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱，流动相为0.05%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），流速为1.0mL/min，梯度洗脱，检测波长为276nm。结果表明，在2.5～100mg/L范围内线性关系良好，相关系数r=0.99998，方法的检出限为1.25mg/kg。不同浓度的加标水平下，测定平均回收率在96%～105%之间，相对标准偏差（n=6）为0.1%～0.9%。该方法操作简便、灵敏度高、检测范围广，适用于各类食品中胭脂虫红含量的检测。

关键词：胭脂虫红；胭脂红酸；高效液相色谱；食品

中图分类号：TS202.3/O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）10-0136-05doi：10.19804/j.issn1006-2513.2019.10.016

Determination of carminecochineal in foods by high performance liquid

chromatography

DONG Chao-xian，ZHANG Chen-xi，ZOU You-cheng，LI Yun，WU Chen，OU Zhen-hao

（National Nutrition Food Testing Center， Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection，

Shenzhen 518110）

Abstract： A method for determination of carmine cochineal in foods by high performance liquid chromatography （HPLC） was developed in this paper. The sample was extracted with hydrochloric acid-methanol and then purified by SPE column， finally detected by high performance liquid chromatography （HPLC） with diode array detector （DAD）， the quantitative analysis was performed by external standard method. Carminic acid was conducted on a C18 column（4. 6 mm × 150 mm，5 μm） with a mobile phase consisted of 0.05% formic acid and acetonitrile under a gradient elution condition at a flow rate of 1.0 mL/min. This method used for determing carminic acid at 276 nm. There was a good linear relationship in the range of 2.5~100 mg/L， with linear correlation coefficient r=0.99998. The detection limit was 1.25 mg/kg. The recovery of standard addition was between 96%~105%. The relative standard deviation（n=6） was 0.1%~0.9%. This method was proved to be fast、sensitive、reliable and good linearity with low relative standard deviation， which can be suitable for the determination of carmine cochineal in various kinds of food.Key words：carmine cochineal； carminic acid； high performance liquid chromatography（HPLC）； food

收稿日期：2019-05-18

作者简介：董超先（1986-），男，本科，工程师，研究方向：食品检测与分析。

136

2019年第10期胭脂虫红色素是近年来逐步受到广泛应用的天然色素，是从寄生在仙人掌上的胭脂虫雌虫体内提取出的一种天然蒽醌类色素，主要成分是胭脂红酸［1］。20世纪90年代，我国首次从国外引进胭脂虫，并人工繁养成功，2002年在云南省有规划种植胭脂虫［2］。胭脂虫红因其稳定、安全等特点，已成为优质的食用色素［3］，它是一种美国食品和药品监督管理局（FDA）允许既可用于食品，又可用于药品和化妆品的天然色素［4］。

国家标准GB 2760-2014［5］中对胭脂虫红在不同种类食品中的使用限量进行了要求。国外一般采用美国化学品法典（FCC）的标准法测定胭脂虫以及其相关产品中的胭脂虫红的含量［6］，我国食品添加剂委员会则采用吸光度来表示胭脂虫红的含量，但是以上两种方法不能应用于食品中胭脂虫红含量的测定。近年来食品中胭脂虫红的相关检测方法的研究不断出现，如反相薄层色谱（TLC）/光密度扫描分析法［7］、高效毛细管电泳法［8］、液相色谱法［9-13］和超高效液相色谱—质谱联用法［14］，但是以上研究所涉及的食品种类较少。本文针对不同类型食品，包括糕点、饼干、糖果、巧克力、熟肉制品等五种，研究了胭脂虫红提取的前处理方法，建立了高效液相色谱法测定食品中的胭脂虫红的含量，可为以后食品中胭脂虫红的监督检测提供有效的参考 方法。

1 实验部分

1.1 样品采集

采集了5种不同类型的样品，包装规格分为盒装、袋装及散装，分别为双莓味红丝绒蛋糕、香肠（原味）、棒棒糖、草莓味夹心饼干、巧克力豆。以上样品依次编号为1～5#。1.2 仪器与试剂

Agilent technologies 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent）；分析天平（德国Sartorius）；台式冷冻离心机3K15（德国SIGMA）；恒温水浴锅DKZ-2B（上海精宏）；旋涡混匀器基本型-MS 3 basicIKA）；聚酰胺固相萃取小柱（60mg/3mL）。

胭脂红酸（CAS1260-17-9，纯度91.7%，

分析测试China Food Additives中国食品添加剂

德国Dr. EhrenstorferGmbH）；乙腈；0.01%、0.05%、0.1%甲酸水溶液；0.1%磷酸水溶液；2mol/L盐酸溶液；酸化甲醇（甲酸∶甲醇= 1∶50；v∶v）；氨水甲醇（体积分数为5%的氨水∶甲醇=1∶1；v∶v）；超纯水。1.3 实验条件1.3.1 标准溶液的配制

准确称取胭脂虫红酸标准品0.1090g（精确称量至0.0001g）于100mL容量瓶中，用超纯水溶解、定容，配制成质量浓度为1000mg/L的储备液（于4℃下保存，保存期3个月）。以胭脂红酸标准溶液为母液，以超纯水为稀释液配制成质量浓度分别为2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、100mg/L系列标准溶液，现配现用。1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 样品的制备 将样品用粉碎机充分粉碎，后装入洁净的可密封盛样容器中，密封并标明标记，于0℃～4℃冷藏保存。

1.3.2.2 样品的提取与净化 称取粉碎均匀的样品2g置于50mL离心管中，加入2mol/L盐酸溶液10mL，旋紧盖子，置于80℃水浴中30min，取出冷却，之后再加入甲醇15mL，振摇混匀，待净化。

以9000r/min转速离心5min，取上清液5mL于15mL试管中，再加入5mL水混匀，将溶液上已活化的聚酰胺固相萃取小柱（2mL酸化甲醇+2mL超纯水进行活化），控制流速为1～2mL/min，用2mL水淋洗小柱，抽干，用2mL的氨水甲醇洗脱，并用10.0mL刻度管收集，再加入300μL甲酸，之后用水定容至2.50mL，混匀，用0.22μm的滤膜过滤后，按色谱条件进行测定。1.3.3 色谱条件

a）色谱柱：Agilent5 TC-C18 5μm×4.6mm× 150mm；

b）柱温：35℃；c）进样量：20μL；d）检测波长：276nm；e）流速：1.0mL/min；

f）流动相：A：0.05%甲酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脱程序见表1。

137

2019年第10期（德国China Food Additives分析测试

表1 梯度淋洗程序

Table 1 Chromatographic gradient program

Time/min0.004.008.0010.0012.00

Flow rate/（ mL/min）

1.0001.0001.0001.0001.000

A/%90.072.040.090.090.0

B/%10.028.060.010.010.0

中国食品添加剂

长的检测结果进行比较，本研究检测波长同时选择276nm和494nm。如图2所示，胭脂红酸在276nm处吸收峰响应值最大，峰形较好。在494nm处峰形最好，且杂质干扰较小，但响应值不如276nm。为了达到更低的检出限，减少定量误差，试验选择检测波长为276nm。

1500mAu10005000

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择2.1.1 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器（DAD检测器）在190～600nm处进行扫描，结果见图1，发现胭脂红酸在紫外区最大吸收波长为276nm，在可见光区最大吸收波长为494nm。为对两个波

250mAu15050-50

a

210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540 570 600

Wavelength/nm

图1 胭脂红酸标准品的吸收图谱

Fig. 1 Standard carminic acid’s absorption spectrum

7050mAu3010

b

0 3 6 9 12

Time/min

-10

0 3 6 9 12

Time/min

图2 276 nm（a）和494 nm（b）下胭脂红酸的色谱图

Fig. 2 Chromatograms of carminic acid at the wavelength of 276 nm（a）and 494 nm（b）

2.1.2 流动相的选择

本实验选用TC-C18（4.6mm×150mm，5μm）柱，通过实验分别比较了不同类型、不同比例的流动相的分离效果。在考虑色谱柱的耐酸性能基础上，实验分别用纯水、磷酸溶液、甲酸溶液作为水相，乙腈为有机相，共研究了乙腈-纯水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液三种体系对测定的影响。结果表明使用乙腈-纯水作为流动相时，完全洗脱不出；使用乙腈-磷酸溶液作为流动相时，出峰时间较慢，峰形出现拖尾现象；使用乙腈-甲酸溶液作为流动相时，分离效果好，峰形对称。

实验发现，pH的降低有利于改善胭脂红酸的峰形。本实验比较了分别以0.01%甲酸溶液和0.05%甲酸溶液作为流动相的分离效果，如图3。甲酸浓度为0.01%时，出峰时间延后，响应值足够高，然而峰形出现拖尾现象，峰较宽且不对

称；甲酸浓度为0.05%时，响应值足够高且峰形效果好。因此本实验选择乙腈-0.05%甲酸溶液体系作为流动相，梯度程序淋洗。

5003001001100900700500300100-100mAu mAua

b

0 3 6 9 12Time/min

图3 胭脂红酸在乙腈-0.01%甲酸溶液（a）和乙

腈-0.05%甲酸溶液（b）体系下的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of carminic acid in acetonitrile-0.01% formic acid （a） andacetonitrile-

0.05% formic acid （b）

138

2019年第10期2.2 样品前处理条件的选择

目前食品中使用的胭脂虫红产品多为胭脂红酸与氢氧化铝反应沉淀所得的红色固体-胭脂红铝，胭脂红铝略溶于醇、热水，不溶于冷水，因此必须将胭脂红铝转化为水溶性的胭脂红酸之后方可进行检测。由文献［15］可知，在酸性条件下，氧化铝或者氢氧化铝可以形成可溶性

的Al（OH2）63+

，色素会与氧化铝或氢氧化铝分

离而溶于水中。因此本实验使用盐酸溶液在80℃水浴中将胭脂红铝转化为水溶性的胭脂红酸进行 检测。

实验考察了2mol/L盐酸溶液5.00mL和甲醇20.0mL，2mol/L盐酸溶液10.0mL和甲醇15.0mL，2mol/L盐酸溶液15.0mL和甲醇10.0mL，2mol/L盐酸溶液25.0mL四种提取液对测定的影响。本实验以阳性样双莓味红丝绒蛋糕1#）为样品，比较了用四种提取液提取之后所得胭脂红酸的峰面积，结果如图四。结果表明，用2mol/L盐酸溶液10.0mL和甲醇15.0mL为提取液时，能有效的去除杂质的干扰，提取效果最好。实验还发现，在酸性条件下，胭脂红酸容易被吸附在聚酰胺填料上，在碱性条件下被解吸释放出来。故本实验采用5%氨水和甲醇（1∶1，v∶v）组成的混合液为洗脱液，对胭脂红酸进行解吸。

2000180016001400120010008006004002000

ciLLccrLLcimmrmmiLLiLrmmrmloh00.lo00lolo...c0h05h00..h0.o5 2co11c50c5rnl r o11 o2doonl rnl r yitndoooodnhuayhindinyotaytahitL lothluhhlu/seL /oteL L lu/othe/olo mloslsl mo mos mdi cdmiddmidmid 2an n cd a2caa2ana2ca图4 四种提取液下峰面积对比图 Fig. 4 Peak areas of four solutions

2.3 标准曲线与检出限

本实验以峰面积为纵坐标（y），以其浓度为横坐标（x，mg/L），绘制标准曲线，回归方程为y=73.23551x-19.78479，相关系数

分析测试China Food Additives中国食品添加剂

r=0.99998。结果表明胭脂红酸在2.5～100mg/L范围内线性关系良好。以取样量2.00g计，本法对样品的检出限为1.25mg/kg（S/N＞3），远低于GB 2760-2014规定的各类食品中胭脂虫红的限量（以胭脂红酸计）。2.4 精密度

将浓度为20mg/L的胭脂红酸标准工作液连续进样6次，测定仪器精密度，胭脂虫红迁移时间的相对标准偏差（RSD）为0.1%，峰面积的RSD为0.8%。连续6次测定阳性样品双莓味红丝绒蛋糕（1#），比较每次测定数据之间的差异，并计算6次测定值之间的相对标准偏差，测定结果重现性较好，相对标准偏差为0.9%。2.5 加标回收率

以空白样品棒棒糖（3#）为本底，加标质量浓度分别为0.0155、0.124、0.249g/kg，按1.3.2节方法制备，上机测定，胭脂红酸的加标回收率见表2。结果表明，方法的平均回收率在96%～105%，满足日常检测需要。

表2 加标回收率测定结果

Table 2 Experimental results of recovery

Average

Sample

BackgroundAddedFoundRecovery

（g/kg）（g/kg）（g/kg）（%）

recovery（%）

0.01

1040.0155

0.01631051050.01621050.122

983#

0

0.124

0.11996960.1150.236

950.249

0.23795960.242

97

2.6 实际样品测定

对双莓味红丝绒蛋糕、香肠（原味）、棒棒糖、草莓味夹心饼干、巧克力豆（1～5#）五个批次的样品中胭脂虫红的含量进行测定，按照1.3.2进行处理检测并计算其含量（以胭脂红酸计），结果见表3。

139

2019年第10期（peak area

China Food Additives分析测试

表3 样品测试结果

Table 3 Determination results of carmine cochineal in

actual samples

Sample1#2#3#4#5#

Carmine cochineal content （calculated as carminic acid， g/kg）

0.1470.025未检出0.0150.032

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中国食品添加剂

3 结论

本研究建立了食品中胭脂虫红含量的检测方法—高效液相色谱法，所检测试样对应食品类型为：焙烤食品、熟肉制品、糖果、代可可脂巧克力及使用可可脂代用品的巧克力制品，基本覆盖GB 2760-2104《食品食品添加剂使用标准》所列允许添加胭脂虫红的常见食品种类。该方法线性范围较宽，灵敏度高，适用范围广，在实际样品检测的操作中具有可行性和准确性，能够满足食品安全检测的需要，可为相关国家标准的制定提供参考。

参考文献：

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第二十四届中国国际食品添加剂和配料展览会暨第三十届全国食品添加剂生产应用技术展示会

Food Ingredients China 2020

展出时间：2020 年3 月 17 日—19 日展出地点：国家会展中心（上海），崧泽大道333号

详情请登陆：www.cfaa.cn

1402019年第10期