皮肤病血毒片的HPLC指纹图谱研究及3个成分的含量测定

西北药学杂志 2017年7月

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(收稿日期=2016-10-08)

皮肤病血毒片的HPLC指纹图谱研究及3个成分的含量测定

史志辉S肖会敏％何悦

％

刘洋3,刘海月S杨旭2，王四旺2* (1.陕西君碧莎制药有限公司，咸

阳

712000;2.第四

军医大学药学院新药研发中心，西安

710032;3.陕西中医药大学，咸

阳

H2046)

HPLC

法。色谱条件：Kromasil C18柱（250 mm X 4. 6 mm，5 pm);流动相为乙腈-5 mL • L 1鱗酸水溶液，梯度洗脱；流速为0. 8 mL.min 1 ;检测波长为254 nm;柱温为25 °CU结果通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A)确定了皮肤病血毒片的 HPLC指纹图谱共有模式，标定了 42个共有峰，相似度为0.958〜0.992;并测得10批制剂中绿原酸、小檗碱和甘草酸的含量分 别为0. 299 7，0. 272 4和0. 208 7 mg •片1，RSD值分别为2. 32%，2. 65%和1. 95%^结论皮肤病血毒片的HPLC指纹图谱

及其中绿原酸、小檗碱和甘草酸的含量检测方法简便、准确、重复性好，可用于该制剂的质量控制。

摘要：目的建立皮肤病血毒片的高效液相色谱（HPLC)指纹图谱，测定绿原酸、小檗碱和甘草酸的含量。方法采用

DOI：10. 3969/j. issn. 1004-2407. 2017. 04. Oil中图分类号：R917 文献标志码：A

关键词：绿原酸；小檗碱；甘草酸；皮肤病血毒片；高效液相色谱法；指纹图谱

文章编号：1004-2407(2017)04-0436-05

Study on the HPLC fingerprint and determination of 3 components in Pifubing- xuedu Tablets

SHI Zhihui1 ,XIAO Huimin2 ,HE Yue2 ,LIU Yang3 ,LIU Haiyue1 , YANG Xu2 ,WANG Siwang2* (1. Shaanxi Junbisha Pharmaceu­tical Limited Company,Xianyang 712000,China； 2. New Materia Medica Research and Development Center, School of Pharmacy, the Fourth Military Medical University,Xi^n 710032 ,China； 3. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046 ,China)Abstract： To establish an HPLC fingerprint method for the quality control of Pifubingxuedu Tablets,and to determine thecontents of chlorogenic acid, berberine and glycyrrhizic acid. HPLC was performed on a Kromasil C18 (250 mmX 4. 6 mm，5 jum) column. The mobile phase was acetonitrile-5 mL • L 1 phosphoric acid solution in a gradient elution mode. The flow rate was 0. 8 mL • min 1 ,the detection wavelength was 254 nm, and the column temperature was set at 25 °C. Under the abovechromatographic conditions ? the characteristic fingerprint peak of Pifubingxuedu Tablets was composed of 42 chromatographic peaks, and the similarity was 0. 958-0. 992 through the chromatographic fingerprint similarity evaluation system (2004A) analy­sis. And the average contents of chlorogenic acid, berberine, and glycyrrhizic acid were 0. 299 7,0. 272 4 and 0. 208 7 mg • tab­let 1 ,respectively,and their RSDs were 2. 32% ,2. 65% and 1. 95% ,respectively,in 10 batches of Pifubingxuedu Tablets.

The method is simple,accurate and have a good repeatability. The study provides a foundation for the quality evaluation and quality control standards of Pifubingxuedu Tablets.Key words： chlorogenic acid; berberine; glycyrrhizic acid;Pifubingxuedu Tablets; HPLC;fingerprint

----------------------------------

基金项目：陕西省科技统筹创新工程计划项目（编号：

皮肤病血毒片由茜草、赤芍、当归、金银花、忍冬

藤、黄桕和甘草等

_ 作者简介:史志辉，男，高级工程师

*通信作者:王四旺，男，教授，硕士，博士生导师

2016KTZDSF010303)

39

味中药组成。诙处方是陕西君

碧莎制药有限公司独家生产的中药复方制剂；具有清

hka血解毒、消肿止痒的作用，用于经络不和与温热血燥

http：//XBYZ. cbpt. cnki. net

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2.3. 1精密度实验

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取供试品溶液（批号

引起的风疹、湿疹、皮肤刺痒、雀斑粉刺、面赤鼻齄、疮 疡肿毒、脚气和疥癖等皮肤病的治疗。方中金银花、 忍冬藤均含绿原酸[1]，具有抗糖尿病、保护心脑血管、 抑制血小板聚集、抗炎和抑制免疫等多方面的药理作 用[28];黄柏具有广泛的药理活性，如抗菌、抗病毒、镇 咳、降压和增强免疫等，其主要活性成分为生物碱，其 中小檗碱是含量最高的生物碱，可达1.4%〜5. 8%[912];甘草具有抗病毒、抗菌、消炎、解毒和减毒 等作用[1317]，其主要功效成分有甘草酸等[18]。本处 方原料药材经粉碎、制粒等工艺制成片剂。为了控制 制剂质量、表征本制剂中的主要活性成分，参照中药 指纹图谱的有关技术要求™进行研究；并采用 HPLC法测定制剂中绿原酸、小檗碱和甘草酸的含 量。1

仪器与试药

仪器高效液相色谱仪( LC-2010Cht，LC/

1. 1

20160506)，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留 时间和相对峰面积进行考察。结果各共有峰的相对 保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于1. 0%和 3.0%，结果表明，该方法精密度良好。

2.3.2稳定性实验取供试品溶液(批号20160506)，

分别于0,2,4,8，12和24 h进样，考察共有峰的相对保 留时间和相对峰面积。结果各共有峰的相对保留时间 与相对峰面积的RSD值分别小于1. 0%和3. 0%，结果 表明，供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2. 3. 3重复性实验取6份供试品(批号20160506)，

按照2. 2. 2项下供试品溶液的制备与2. 1项下色谱 条件进行分析，分别对共有峰的相对保留时间和相对 峰面积进行考察。结果各共有峰的相对保留时间和相 对峰面积的RSD值分别小于1.0%和3.0%，结果表 明，该方法重复性良好。

Labsoluion色谱工作站），日本岛津公司；ME235S电

子分析天平，德国赛多利斯公司；KQ-300DE数控超

声波发生器，昆山超声仪器有限公司。1. 2

试药乙腈、甲醇为色谱纯，美国Honeywell公 司；水为超纯水，由美国Millipore纯水仪制得，美国

2.3.4指纹图谱的建立及相似度分析取10批皮

肤病血毒片样品，分别按照供试品溶液的制备与色谱 条件进行分析，进样量10 pL，记录指纹图谱，见图1。

Millipore公司；绿原酸、小檗碱和甘草酸对照品，均购 20160506, 20160507, 20160508, 20160509, 20160510, 20160511,20160512, 20160513, 20160514, 20160515)，

均由陕西君碧莎制药有限公司提供。2

指纹图谱的测定方法与结果

自中国食品药品检定研究院；皮肤病血毒片(批号

2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil (318柱（250 mmX

4. 6 mm，5 pm);流动相：乙腈(A)-5 mL • L 1磷酸水 溶液(6)，梯度洗脱，0〜2〇111丨11，：6:97%—85%;20〜 40 min，B:85% —75%;40〜45 min，B:75% —70%; 45〜70 min，B:70% —40%。记录时间为 70 min。 流速：〇. 8 mL • min 1 ;柱温：25 °C ;检测波长：254

。

nm;进样量：10 pL™

1〜42.特征指纹峰；14.绿原酸(作为参照物的色谱峰）；33.小

檗碱；38.甘草酸

Fig. 1 HPLC fingerprint of Pifubingxuedu Tablets 1-42 ：characteristic fingerprint peak； 14. chlorogenic acid (ref­erence peak) ；33. berberine；38. glycyrrhizic acid

由图1可知，峰14为绿原酸，即参比物。10批

样品共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的 R s D值分别小于1. 0 %和3. 0 %，与指纹图谱研究技 术的要求相符，见图1〜2。运用国家药品监督管理 局颁发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂 行）》[19]对10批皮肤病血毒片的指纹图谱进行相似 度分析，将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度 计算软件，对选定的42个共有色谱峰进行色谱峰匹 配，计算得出样品指纹图谱的共有模式，并以此共有 模式为标准，进行整体相似度评价，相似度为〇. 958 〜0.992,结果表明，这10批皮肤病血毒片的化学成 分一致性较好。

2. 2 参比物及供试品溶液的制备

2.2.1参比物溶液的制备精密称取绿原酸对照品

适量，加甲醇制成质量浓度为0. 1 mg • mL 1的溶

液，摇匀，即得。

2.2.2供试品溶液的制备取本品粉末5 g，精密称

定，置于具塞锥形瓶中，加体积分数为50%的甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 kW，频率 40 kHz)30 min，放凉，再称定质量，用体积分数为 50%的甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤 过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

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照品溶液，作为储备液，见图3。

0 10 20 30

，/min

40 50 60 70

图3

混合对照品HPLC图谱

Fig. 2 HPLC fingerprints of 10 batches of Pifubingxuedu Tab­

lets

3

含量测定的方法与结果

3.1色谱条件同2.1项下色谱条件。

3.2 混合对照品溶液的配制精密称取绿原酸

12. 00 mg、小檗碱6. 00 mg和甘草酸8. 00 mg，置于 10 mL量瓶中，加体积分数为50%的甲醇定容至刻 度，摇匀，即得绿原酸、小檗碱与甘草酸质量浓度分别 为 1 200. 00,600. 00 和 800. 00

表1

对照品的线性方程和范围

1.绿原酸；2.小檗碱；3.甘草酸

Fig. 3 HPLC chromatogram of reference substance mixture 1. chlorogenic acid；2. berberine|3. glycyrrhizic acid

3. 3 线性关系精密量取储备液0, 05,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40和0. 50 mL，分别置于1 mL量瓶中，加体 积分数为50%的甲醇稀释至刻度，用0. 45 微孔 滤膜滤过，进样。以各对照品的质量浓度（X， pg-mL1)为横坐标、峰面积值（3；)为纵坐标，计算得 线性方程，见表1和3,结果表明，各对照品在相应质

量浓度范围内线性关系良好。

• mL 1 的混合对

Tab. 1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substances

对照品名称绿原酸小檗碱甘草酸

线性范围/V

g.mL 一1

线性方程

r0. 999 40. 999 20. 999 i

60, 00〜600, 0.030.00〜300.0040. 00〜_. 00

3=16 879 125;—67 947^f = 24 531.t2-104 1103；3 = 1〇 226 5.r3 - 18 329

3. 4供试品溶液的制备按照2. 2. 2项下方法制备

供试品溶液，指纹图谱见图1。

3.5阴性对照溶液的制备依据2. 2. 2项下方法分 别制备缺金银花与忍冬藤、缺黄柏和缺甘草的阴性对 照溶液。结果表明，阴性对照溶液无干扰，见图4。3.6

精密度实验精密吸取供试品溶液（批号

2016Q5Q6)，重复进样5次，测得绿原酸、小檗碱和甘 草酸的RSD值分别为1. 14%，0. 94%和0. 95%，结 果表明，该方法精密度良好63.7

重复性实验精密称取6份样品（批号

20160506)，分别按照2. 2. 2项下方法制备供试品溶 液，按照2.1项下色谱条件进样测定。结果显示，绿 原酸、小檗碱和甘草酸的平均含量分别为0. 569 9,0. 412 4 和 0. 536 2 mg • g 1，RSD 值分别为 0. 98%，1. 02%和1. 09%，结果表明，该方法重复性良好。3.8 稳定性实验精密吸取供试品溶液（批号 2016Q5Q6)，分别在第0,2,4,8，12和24 h进样。结 果绿原酸、小檗碱和甘草酸峰面积的RSD值分别为 1.12 %，1.10 %和1.05%，结果表明，该溶液在24 h 内稳定性良好。

图4

A.缺金银花与忍冬藤药材的阴性对照;B.缺黄柏药材的阴性对 照;C.缺甘草药材的阴性对照;1.绿原酸;2.小檗碱;3.甘草酸 Fig. 4 HPLC chromatograms

A. the negative control of missing Lonicerae japonicae flos and Lonicerae japonicae caulis; B. the negative control of missing Phellode?ideri chinensis cort& ；C. the negative control of missing glycyrrhizae radiM $t rhizoma ;1. chlorogenic acid; 2. berberine;3. glycyrrhizic acid

HPLC图

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容至刻度，按照2.2. 2项下方法制备供试品溶液，共 6份，按照2. 1项下色谱条件进样测定，见表2。结果 表明，该方法回收率良好。

3.10

3.9

加样回收率实验精密量取皮肤病血毒片（批

号20160506,其中绿原酸、小檗碱和甘草酸的含量分 别为 0• 569 9,0. 412 4：和 0• 536 2 mg . g—1”. 0 g，添 加混合对照品溶液（精密称取绿原酸、小檗碱和甘草 酸适量，制成在体积分数为50%的甲醇中质量浓度 分别为 1.45,1.00 和 1.35 mg . mL-1 的溶液）1. 60， 2. 00和2. 40 mL，再加人质量浓度为50%的甲醇定

表2

加样回收率测定结果

含量测定精密量取10批样品，分别按照

2. 2. 2项下方法制备供试品溶液，按照2. 1项下色谱 条件进样测定。各批样品中绿原酸、小檗碱和甘草酸 的平均含量、RSD值见表3。

Tab. 2 Results of sample recovery test

化合物

绿原酸

称样量/g

原有量/mg

加人量/mg

测定量/mg

回收率/%

平均回收率/%

小檗碱

甘草酸

5. 021 5

5. 043 45. 021 25. 020 95. 020 35. 031 15. 021 55. 043 45. 021 25. 020 95. 020 35. 031 15. 021 55. 043 45. 021 25. 020 95. 020 35. 031 12. 861 82. 874 22. 861 62. 861 42. 861 12. 867 22. 070 92. 079 92. 070 72. 070 62. 070 42. 074 82. 692 52. 704 32. 692 42. 692 22. 691 92. 697 72. 322. 322. 902. 903. 483. 481. 601. 602. 002. 002. 402. 402. 162. 162. 702. 703. 243. 245. 151 85. 134 25. 721 85. 761 16. 270 96. 300 23. 630 13. 628 84. 0 34. 041 94. 435 . 452 74. 830 34. 822 15. 362 55. 342 85. 863 15. 872 5

4 讨论

98. 7197. 4198. 6399. 9997. 98. 6597. 4596. 8199. 68. 5698. 5599. 08. 9798. 0598. 98. 1797. 87. 99

98. 56

RSD/%0. 88

98. 351. 08

98. 320. 69

表3皮肤病血毒片3个成分含量测定结果

Tab. 3 Contents of 3 components of Pifubingxuedu Tablets

绿原酸

小檗碱

甘草酸

采用全波长对皮肤病血毒片的样品进行测定，依

____________________________________________据三维色谱图及对应波长下峰的信息量，检测波长在

批号

254 nm处信息量较多，同时3个化合物与相邻各峰 的分离度均>1.5,故将其作为HPLC指纹图谱的定性波长与3个化合物的定量波长。

由于中药复方中成分众多且溶解性不同，难以充分洗脱，因此选用 Kromasil C18 (250 mm X4. 6 mm,5 ym)色谱柱，采用梯度洗脱法进行洗脱。

比较了乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液和乙腈-水4个不同流动相系统。对2,4,5,8和

/ mg •片10. 285 00. 295 80. 306 60. 300 60. 303 10. 293 20. 297 30. 303 20. 305 20. 306 80. 299 7 2. 32

/mg •片 1/mg •片 10. 268 10. 278 30. 279 70. 285 10. 278 80. 267 10. 2 70. 268 30. 267 30. 267 00. 272 4 2. 65

0. 206 20. 212 90. 212 60. 210 10. 202 60. 206 80. 207 70. 202 60. 212 50. 212 50. 208 71. 95

20160506201605072016050820160509201605102016051120160512201605132016051420160515

平均含量

10

的磷酸水溶液进行比较。结果显示，各

流动相系统中以乙腈-5 mL • L-1磷酸水溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度与保留时间均符合要求，因此选乙腈-5 mL • L-1磷酸水溶液流动相系统作为本制剂指纹图谱的流动相系统。

对制样方法进行比较，采用体积分数分别为 30%，40%，50%，60%，70%，80%和 100% 的甲醇作

RSD/ %

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440

为溶剂；处理方法：超声10,15,20,30,40和50 min 或加热回流20,30,40和60 min。结果表明，体积分 数为50%的甲醇超声30 min较理想，原因是制剂工 艺为全粉人药，采用该方法能较好地保证水溶性与脂 溶性成分的信息与含量；对不同柱温与流速进行比 较，柱温超过或低于25 °C，但大部分色谱峰分离度小 或不能分开；流速高于或低于〇. 8 mL • mirT1，大部 分色谱峰分离度差；色谱记录时间在70 min后，无色 谱峰出现。因此，选择便于控制的柱温20 °C、流速 0• 8 mL . min-1、记录时间70 min和体积分数为 50%的甲醇超声30 min制备样品。

综上所述，对10批次的皮肤病血毒片样品进行 相似度计算，结果为0.958〜0.992。3种成分定量结 果含量均一稳定，阴性无干扰，表明所建立的皮肤病 血毒片的HPLC指纹图谱研究与含量测定方法有良好 的分析评价能力，具有简便、稳定可靠、准确等优势。 因此，该方法可作为评价该制剂质量的有效方法。参考文献：

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(收稿日期=2016-09-23)

正交实验法优选沙棘果油的提取工艺

李

炜

李

瑾

S陈英1，单娜1，陈衍斌S刘峰

^l.陕西国际商贸学院，咸

阳

712046;2.陕西步长制药有限公

司，西安 710061)

°C，以8 000 r • min 1离心10 mit结

论该提

摘要：目的优选沙棘果油的提取工艺。方法采用正交实验设计，以沙棘果油提油量和棕榈酸含量为指标优化提取工艺；并采

用气相色谱法测定棕榈酸的含量.结果优选提取工艺条件为果浆加热至60

取工艺简单、稳定。

DOI：10. 3969/j. issn. 1004-2407. 2017. 04. 012中图分类号：R284 文献标志码：A

关键词：沙棘果油；棕榈酸；正交实验

文章编号：1004-2407(2017)04-0440-04

基金项目：咸阳市重大科技专项计划项目（编号：2014k01-18)

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