6.微生物的营养

6.1 微生物的营养要求

微生物的特点：食谱广、胃口大

一、微生物细胞的化学组成 微生物细胞：水：70%-90%；

干物质：无机物（盐）

有机物：蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等及其降解产物

细胞化学元素组成：

主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等

微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性”

二、营养物质及其生理功能

碳源 氮源 无机盐 水

生长因子

1. 碳源(carbon source)：凡是可以作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质。 功能：构成细胞物质；能源

有机碳化物：C·H·O·N·X 复杂蛋白质,核酸（牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉等）

C·H·O·N 多数氨基酸,简单蛋白质（一般氨基酸、明胶等） C·H·O 糖,有机酸,醇,脂（葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等常用碳源） C·H 烃（天然气、石油及其不同馏份、石蜡油等）

无机碳化物 C·O CO2(真菌一般不利用CO2)

C·O·X NaHCO3, CaCO3

五大营养要素 细菌在葡萄糖、乳糖混合培养基中的二次生长现象（双峰生长）

 葡萄糖效应 (P251)

当培养基中存在葡萄糖时，其他碳源的利用会严格受到抑制，直到葡萄糖完全消耗为止。

Jacob和 Monod首次研究了葡萄糖效应，提出了操纵子概念，由此获得了诺贝尔奖。他们的工

作开创了原核基因的时代。

微生物工业发酵中用做碳源的原料

 传统种类：糖类（单糖，饴糖）、淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物等）、麸皮、麦芽、糖蜜、各

种米糠等

 代粮发酵：纤维素、CO2

2. 氮源(nitrogen source) ：凡是可以作为微生物细胞结构或代谢产物中氮元素来源的营养物质。功能：构

成细胞物质；少数作能源

氮源 有机氮化物 N·C·H·O·X 复杂蛋白质,核酸（牛肉膏、酵母膏、饼粕粉、蚕蛹粉等）

N·C·H·O 尿素,氨基酸,简单蛋白质（尿素、蛋白胨、明胶等）

无机氮化物 N·H NH3, NH4+ （(NH4)2SO4等）

N·O NO3 （KNO3）等

N N2 空气（固氮原核微生物）

 工业常用氮源：玉米浆，花生粉，黄豆粉等

生理酸性盐：如（NH4）2SO3 生理碱性盐：如KNO3

速效氮源：蛋白胨、铵盐、盐、玉米浆等 → 菌体生长 迟效氮源：花生粉，黄豆粉等→ 代谢产物生成

3. 无机盐：为M的生命活动提供除碳、氮源之外的各种重要元素。

配制培养基时，一般首选K2HPO4和MgSO4补充大量元素。

元素人为提供形式生理功能 PKH2PO4、K2HPO4核酸、磷酸和辅酶的成分 SMgSO4含硫氨基酸、含硫维生素成分KKH2PO4、K2HPO4酶的辅因子、维持电位差和渗透压 NaNaCl维持渗透压、某些细菌和蓝细菌需要 CaCa(NO3)2、CaCl2胞外酶稳定剂、蛋白酶辅因子、细菌芽孢和真

菌孢子形成

MgMgSO4固氮酶辅因子、叶绿素成分

FeFeSO4Cyt成分；合成叶绿素、白喉毒素和氯高铁血 红素所需 MnMnSO4超氧化物歧化酶、氨肽酶、L-阿拉伯糖异构酶等的辅因子

CuCuSO4氧化酶、酪氨酸酶的辅因子 CoCoSO4VB12复合物的成分、肽酶的辅因子

ZnZnSO4碱性磷酸酶、脱氢酶、肽酶、脱羧酶辅因子

Mo(NH4)6Mo7O24固氮酶和同化型及异化型盐还原酶的成分

4.生长因子(growth factor)： 微生物正常代谢必不可少,而且不能用简单的碳源或氮源自身合成或合成量不足的有机化合物.

氨基酸→蛋白质，细胞壁等的主要成分 嘌呤和嘧啶→核酸和辅酶的组成成分

维生素→构成酶的辅酶或辅基，是酶活性所需成分（最早发现的生长因子）

配制培养基时，通常加入酵母膏、玉米浆、麦芽汁或动植物组织浸出液以补充生长因子

例：某些微生物对生长因子的需求具有较高的专一性，可利用它们通过“微生物分析”(microbiological assay)对样品中维生素或氨基酸进行定量。设计实验利用某微生物对某一样品中维生素B12的含量进行分析。 （1）将缺乏维生素B12但含有过量其它营养物质的培养基分装于一系列试管，分别定量接入用于测定的微生物；

（2）在这些试管中分别补加不同量的维生素B12标准样品及待测样品，在适宜条件下培养； （3）以微生物生长量（如测定OD600值）对标准样品的量作图，获得标准曲线；

（4）测定含待测样品试管中微生物生长量，对照标准曲线，计算待测样品中维生素B12的含量。

5.水：

水活度为在一定的温度条件下，溶液的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比。 即：w=/ o  表示溶液的蒸汽压，o表示纯水的蒸汽压。 w为0.60-0.99的环境条件均有微生物生长

三、微生物的营养类型

（根据碳源和能源划分） 营养类型 主要碳源 能源 电子供体 举例 光能自养型 CO2 光 无机物 兰细菌、紫硫细菌、绿硫细菌等 化能自养型 CO2 无机物 无机物 硝化细菌、硫细菌、铁细菌、氢细菌等 光能异养型 有机物 光 有机物 红螺菌等 化能异养型 有机物 有机物 有机物 绝大多数细菌和全部真核微生物  自养微生物与异养微生物的主要区别：

自养微生物：可利用CO2（碳酸盐）作唯一或主要碳源且同化CO2 （碳酸盐）为细胞结构物质，所需能量来自光或无机物的氧化，但也不能说它们绝对不能利用有机物；

异养微生物：可以固定CO2 ，但其主要的碳源来自有机物，不能在完全无机的环境中生长，合成反应所需能量来自有机物的氧化或光能。

 微生物营养类型的可变性

6.2 培养基

培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。

一 配制培养基的原则 1、目的明确

细菌 → 牛肉膏蛋白胨培养基 (NA) LB培养基

放线菌 → 高氏一号培养基 酵母菌 → 麦芽汁培养基 霉菌 → 查氏培养基

真菌 → 马铃薯培养基 (PDA)

2、营养协调

碳氮比(C/N)：碳源与氮源含量之比。（碳源中碳原子摩尔数与氮源中氮原子摩尔数之比）。碳氮比直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标

 例：微生物发酵生产谷氨酸： C/N为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； C/N为3/1时，菌

体繁殖受到抑制，谷氨酸大量积累

3、理化适宜 （1）pH：

通常培养条件：细菌与放线菌：pH 7~7.5 酵母菌和霉菌：pH 4.5~6  pH变化的原因：

 糖类→发酵、氧化→有机酸→变酸  脂肪→水解→有机酸→变酸

 (NH4)2SO4 → 吸收NH4＋→ H2SO4 →变酸  蛋白质→脱羧→胺类→变碱

 NaNO3 →吸收NO3－→NaOH →变碱

内在调节：K2HPO4和KH2PO4是常用的缓冲剂 不溶性CaCO3作为备用碱

外源调节：不断流加酸液或碱液

（2）O2：

 好 氧： 振荡、通气、搅拌；加氧化剂

 厌 氧：除氧，加还原剂（抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等）

例：厌氧菌培养基：蛋白胨5g，酵母膏10g，葡萄糖10g，胰酶解酪蛋白5g，盐溶液10mL，0.025%刃天青4mL，半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g，水1000mL，pH7.0，121℃，20min

半胱氨酸为还原剂，刃天青是氧化还原指示剂，具有双重作用：有氧条件下起pH指示剂的作用，即碱性时呈蓝色，酸性时呈红色；培养基处于无氧状态时，刃天青变为无色

（3）渗透压：加入适量NaCl调节渗透压

例：L型细菌加3%—5%NaCl或10%—20%蔗糖

4、经济节约：当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，提倡以粗代精，以废代好。

例：某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。

 优化、设计培养基的方法

生态模拟：研究某种微生物的培养条件； 文献查阅：借鉴经验，启发设计；

精心设计：借助优选法或正交试验设计进行特定微生物配方的设计 试验比较：确定特定微生物的最佳培养条件

二、培养基的类型及应用 1．按成份不同划分

（1）天然培养基：以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成

 优点： 营养丰富且较经济，配制方便  缺点 ： 成分不清楚，不稳定  应用： 实验室及实际生产

（2）合成培养基：是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemically defined medium)。高氏一号，查氏培养基

 优点： 组分清楚，重演性高

 缺点： 价格昂贵，配制麻烦，生长较慢

 应用： 营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种 鉴定等对定量要求较高的研究工作

2．根据物理状态划分:

（1）固体培养基； 用于微生物菌种分离、鉴定、计数、保藏

加1.5%—2% 琼脂或5%—12% 明胶

无机硅胶：自养微生物 天然固态

滤膜

琼脂与明胶若干特性的对比： 化学成分 营养价值 无 分解性 融化温度 ℃ 96 凝固温度 ℃ 40 透明度 耐温 常用浓度 琼脂 聚半乳糖硫酸酯 蛋白质 罕见 高 强 1- 2% 明胶

做氮源 极易 25 20 高 弱 5-12% 理想凝固剂应具备的条件：1.不被微生物分解、利用、液化；

2.不因消毒灭菌而被破坏；

3.在微生物的生长温度内保持固态； 4.凝固点的温度对微生物无害； 5.透明度好，粘着力强。

(2) 液体培养基:在科研或生产中通过发酵获得菌体或代谢产物 ，在生产实践上，绝大多数发酵培养基都采用液体培养基

(3) 半固体培养基: 0.5% 琼脂。观察微生物运动特征、厌氧菌的培养等 （4）脱水培养基：营养琼脂、营养肉汤、M17肉汤、麦康凯培养基等

3．按用途划分

1）基础培养基(minimum medium，MM，[-])

含有一般微生物生长所需基本营养物质的培养基。

2）加富培养基 (enrichment medium)

在基本培养基中加入某些特殊的营养物质，适于某些特殊营养要求的微生物的生长，也可以用来富集和分离某种微生物的一类营养丰富的培养基。

3）鉴别培养基(differential medium)

用于鉴别不同类型微生物的培养基特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分开来。例：EMB培养基

原理：在低酸度条件下，伊红和美兰可以结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。大肠杆菌能强烈分解乳糖产生大量的混合酸，菌体表面带H+，故可染上酸性染料伊红，伊红又与美兰结合，使菌落染上深紫色，且从菌落表面的反射光可看到绿色金属光，产酸力弱的菌落也有相应的棕色。见下表：

 用于饮用水、牛奶的大肠菌群数等细菌学检查

大肠菌群：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群是粪便污染的指标菌。

例：酪素平板：鉴别蛋白酶产生菌

明胶培养基：鉴别蛋白酶产生菌 淀粉培养基：鉴别淀粉酶产生菌

4）选择培养基(selective medium)

根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。 例：抑制型选择培养基：

放线菌酮、制霉菌素 →分离细菌

添加青霉素、四环素等抗生素 →分离酵母菌、霉菌

加富型选择培养基：

以纤维素为唯一碳源→分离纤维素分解菌

6.3 营养物质进入微生物细胞

一、扩散(diffusion)：不是微生物吸收物质的主要方式

特点：高浓度→ 低浓度；不耗能；没有膜载体参加；运输速率较慢 可运送的养料有限，主要包括：水、氧气、二氧化碳等。

二、促进扩散(facilitated diffusion)

特点：高浓度→ 低浓度；不耗能；有膜载体参加

1 透过酶大都是诱导酶,只有在环境中存在机体生长所需的营养物质时，相应的透过酶才合成 2 每种载体只运输相应的物质，具有较高的专一性 3 载体的饱和效应

4 载体并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态，只是起到加快运输速度的作用 通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有:甘油、氨基酸、糖等。

离子载体的运输模式：动态载体和静态载体。例：缬氨霉素、尼日利亚菌素是动态载体；短杆菌肽A属静态载体。

三、主动运输(active transport)：微生物吸收物质的主要方式

特点：需要消耗能量；逆浓度运输；有膜载体参加（改变平衡点的作用，可以在细胞内部高浓度积累某些营养物）

通过主动运输进入细胞的营养物质主要有:氨基酸、糖类、Na+、Ca2+等无机离子。 1.初级主动运输：

呼吸能、化学能和光能的消耗，引起胞内质子（或其他离子）外排，导致原生质膜内外建立质子浓度差，使膜处于充能状态，即形成能化膜

2.次级主动运输： 同向运输 逆向运输 单向运输

 基团转位(group translocation)：基因转位主要存在于厌氧和兼性厌氧型细菌中，主要用于运送糖类、

核苷酸、丁酸、腺嘌呤、脂肪酸等。

特点：物质在运输过程中发生化学变化（磷酸化）；需要消耗能量；逆浓度运输；有膜载体参加 磷酸糖转移酶运输系统（PST）的组成：酶Ⅰ；酶Ⅱ；热稳定蛋白HPr 1)热稳载体蛋白(HPr)的激活

细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。 酶Ⅰ

PEP + HPr 丙酮酸 + P-HPr

2）糖被磷酸化后运入膜内

膜外环境中的糖先与外膜表面的酶Ⅱ结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶Ⅱ的作用将糖-磷酸释放到细胞内。

酶Ⅱ

P-HPr + 糖 糖-P + HPr

四、膜泡运输(memberane vesicle transport)

比较项目 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团转位

特异载体蛋白 无 有 有 有

运输速度 慢 快 快 快 物质运输方向 由浓至稀 由浓至稀 由稀至浓 由稀至浓 胞内外浓度 相等 相等 胞内浓度高 胞内浓度高 运输分子 无特异性 特异性 特异性 特异性 能量消耗 不需要 不需要 需要 需要 运输后物质的结构 不变 不变 不变 改变