循环肿瘤细胞的检测

李帅;刘晓强

【摘 要】循环肿瘤细胞的检测有助于研究肿瘤转移机制、指导肿瘤治疗、判断治疗效果、为推断预后提供可靠参考、监测肿瘤的转移或复发.随着研究的进展,循环肿瘤细胞逐渐被人们所重视.外周血中循环肿瘤细胞的数目较少,精确分离很困难.目前用于循环肿瘤细胞检测的方法很多,通常包括富集技术和分析技术两个部分,实际操作中常需要选择两个部分的不同方法加以有效结合;近年来随着实验技术的进步,建立了兼有富集和分析功能的细胞搜索系统.

【期刊名称】《医学综述》

【年(卷),期】2010(016)006

【总页数】4页(P928-931)

【关键词】循环肿瘤细胞;检测方法;富集;分析;细胞搜索系统

【作 者】李帅;刘晓强

【作者单位】天津医科大学第二医院泌尿外科,天津,300211;天津医科大学第二医院泌尿外科,天津,300211

【正文语种】中 文

【中图分类】R446.1

血循环中检测到循环肿瘤细胞并不意味着有远处转移,但转移的概率会大大增加。如果在转移灶出现前就能预测患者将要发生转移,就可以采取更加积极主动的治疗。早在 1869年,Ashworth[1]就报道在 1例癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞,并首次提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的概念。但由于外周血中 CTCs的数目较少,精确分离很困难,了 CTCs的应用。随着人们对肿瘤转移机制研究的深入,尤其是伴随现代检测技术的广泛应用,CTCs逐渐被人们所重视。目前用于 CTCs检测的方法很多,通常包括富集技术和分析技术。富集技术主要通过一些物理化学原理将这些细胞特异性地富集起来,提高 CTCs检测的敏感性。分析技术主要依靠肿瘤细胞上存在的一些肿瘤特异性或器官特异性标记以及肿瘤细胞本身的形态学特征来发现 CTCs。实际操作中常需要选择两个部分的不同方法并加以有效结合,最终寻找出敏感性和特异性均较高的方法。近年来,随着 CTCs研究的进展和实验技术的进步,建立了兼有 CTCs富集和分析功能的细胞搜索系统。

1.1 磁性细胞分选 磁性细胞分选的原理是先将特异性抗体包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁性微珠,再与靶细胞上的抗原结合成“靶细胞-抗原抗体-磁珠”复合物,该复合物具有磁响应性,在外加磁场的作用下能向一定方向移动,这样靶细胞就能得到富集。然后被富集的肿瘤细胞可以通过免疫细胞化学、流式细胞仪等方法进行分析。

由于技术的,早期的磁珠只能达到微米级,因此细胞分离效率低,且分离出的细胞只

有与磁珠解离后才能恢复活性以进行进一步的检测。近年来,纳米技术的应用使磁珠大小达到了纳米级(10～100 nm),不会对细胞造成机械性压力;磁性抗体和磁性标志物间的反应可在几分钟内完成,可以迅速形成一个稳定的胶体溶液,在磁场中既不沉淀又不凝聚。纳米磁珠的大小和它的组成成分(四氧化三铁和多糖)使其可被生物降解,且不会影响细胞的功能和活力,磁珠不需要去除,分选出的细胞可立即用于分析和随后的实验。由于具有高特异性、高分离率且不影响细胞活性等特点,它能够从大量细胞中筛选出带有特异性标记的极少量细胞[2]。

磁性细胞分选技术的策略包括阳性筛选、阴性筛选以及两种方法的结合。阳性筛选使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠,细胞与磁珠结合后,直接在磁场中被分离出来。阴性筛选通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化。在检测中阳性选择的效率受到肿瘤细胞表面靶抗原表达强弱的影响,抗原表达弱的肿瘤细胞可能丢失。在使用阴性筛选检测 CTCs时,一般选择磁珠表面结合 CD45抗体,这可以去除血液中大多数的白细胞。

1.2 膜滤过法 Vona等[3]建立了膜滤过法用于分离和计数 CTCs,该方法也称为通过细胞大小进行的上皮细胞分离。由于上皮肿瘤细胞比外周血细胞大,过滤可使上皮肿瘤细胞得到分离。这种简单、经济的技术优点明显。首先,它的敏感度高,在 1 m L血中加入 1个肿瘤细胞也可检出[3];而且,它可以维持细胞形态完全不受损,分离后的细胞可用于细胞染色、免疫标记等进一步研究;另外,它还可用于检测其他方法均无法检测的循环肿瘤微栓子[4]。但膜滤过法不适合那些细胞体积 ＞2倍粒细胞大小的肿瘤,况且同一患者的循环肿瘤细胞大小也不一致,所以很难做到检测出所有的肿瘤细胞。

1.3 密度梯度离心法 根据血液中的各种细胞的密度不同,利用一种特定密度且近于等

渗的溶液(分层液)与标本加入同一试管后离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将血液中各种细胞加以分离。分离后可以进行细胞染色、免疫标记等进一步的分析。用密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞(包括 CTCs),一般用菲柯尔溶液、淋巴细胞分离液或其他相似密度的分离溶液,离心后,从下到上依次是:红细胞、中性粒细胞、分离液、单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞、肿瘤细胞),最上层为血浆成分,肿瘤细胞有时可迁至血浆层。操作时如全血与分离液混合后不马上离心,血细胞有可能掺入分离液而不利于分离。后来在此基础上建立起来的 OncoQuick方法,用一种专用的 50 m L的试管,内置多孔屏障,其下为密度梯度分离液,使用时将标本置于屏障之上从而避免在离心之前与分离液混合,与前相比,更易从粒细胞中分离出肿瘤细胞,从而更有利于进一步的分析[5]。

该法的局限性在于由于部分肿瘤细胞可迁至血浆层或与留于红细胞或中性粒细胞中,因而在分离过程中可能丢失少量 CTCs,其敏感性较低且依赖于肿瘤细胞的特性、离心的时间、温度等多种因素。

2.1 免疫细胞化学技术 免疫细胞化学是利用抗原与抗体特异性结合的原理,使显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)标记的抗体与特异的肿瘤标志物(主要包括上皮细胞角蛋白 CK、上皮细胞膜特异性抗原等)结合,通过酶和底物反应显色或其他显色方法来判断肿瘤细胞的存在。免疫细胞化学是检测CTCs的成熟方法之一,简便、直观并可以进行形态学分析,但其敏感性只有 105左右,而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原,而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,加之镜下对结果观察和判读的主观性较强,这些都了免疫细胞化学在 CTCs检测中的应用。所以目前较少单独应用免疫细胞化学检测 CTCs。

2.2 反转录-聚合酶链反应 反转录-聚合酶链反应检测 CTCs是基于组织或肿瘤特异性 mRNA的表达或某些基因改变后 DNA水平的异常,这些 mRNA不表达于正常外周血细胞,所以在外周血中检测到特异 mRNA可以间接提示 CTCs的存在。该方法近来较多地用于检测多种实体瘤患者外周血肿瘤相关基因,借以分析 CTCs的存在,如对消化系统作 CEA mRNA检测[6]等。反转录-聚合酶链反应具有高效率、高敏感度的优点,可以鉴别出 106～107个正常细胞(相当于 0.1～1m L血)中一个靶细胞。由于肿瘤细胞的异质性,个体间肿瘤标记的表达差异,虽然有学者多标志联合检测将提高了检出率[7],但反转录-聚合酶链反应技术仍有缺点,如取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达及假基因干扰等原因导致的假阳性结果等,无法进行形态学观察、无法对外周血肿瘤细胞定量则是影响它应用于CTCs检测的最大障碍。

2.3 流式细胞分析 流式细胞分析是一种高速的细胞分析和分选技术,它利用肿瘤细胞单抗结合荧光物质使肿瘤细胞染色,然后用流式细胞仪进行分析,染色细胞被视为阳性,大致敏感性为 1/105。流式细胞术检测肿瘤细胞的优点在于可在免疫放大检测的同时进行细胞形态测定,可以提供 DNA倍数关系,而且测量速度快,还可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数分析。流式细胞术也有着局限性,例如缺乏规范的操作方法,且敏感性较低。现有的流式细胞仪需大约 50mL外周血方可检测肿瘤细胞负荷,但采用磁性细胞分选技术进行富集可显著提高流式细胞分析检测 CTCs的敏感性[8]。

Georgakoudi等[9]报道了近年来出现的活体流式细胞仪,它是一种新的生物医学光学仪器,结合了活体实时高速影像方法和体外流式细胞仪,可实时检测活体 CTCs。它在血液流动过程中通过放置于血管某处横截面的一束激光来检测带有荧光标记的癌细胞,受激发的荧光信号通过光电转换和模数转换在计算机中储存,通过一段时间内检测荧光信号来实时

记录循环系统中流过的癌细胞数量。这种方法主要的特点是不用抽血,属于微创诊断方法。

2.4 激光扫描细胞计量技术 激光扫描细胞计量技术(laser scanning cytometry,LSC)是高通量细胞分析仪,具有流式细胞仪和图像细胞仪的功能,可通过连续扫描荧光显微镜下图象自动分析产生数据,可在一定时间(0.5～1 h)内在显微镜下自动筛查 5×104个细胞,如与细胞富集技术相结合,经过荧光染色后可达到在 107个细胞中发现 1～2个肿瘤细胞的敏感性。由于背景等原因无法用流式细胞仪分析的样本也可用 LSC进行细胞定量检测。LSC能通过目镜直接观察细胞及细胞核形态,且 LSC显微镜光学系统以激光为光源,具有普通光学显微镜无法相比的高敏感度、高分辨率、高放大倍数的特性,可对细胞内微细结构进行定性、定量、和定位分析。Pachmann等[10]首次将 LSC运用于外周血少量肿瘤细胞的检测,并用一系列对照实验研究建立了标准化操作规程即 MAINTRAC分析——LSC进行分析,对细胞进行重新定位后直接观察、定量并拍摄荧光照片的分析过程。他们用 MAINTRAC分析检测各期的乳腺癌和肺癌患者,临床检测阳性率达 92%,检测特异度为 97%。

2.5 生物芯片技术 生物芯片技术是根据生物分子之间特异性相互作用的原理,如 DNA-DNA、DNARNA之间可发生的复性与特异性结合,设计其中的一方为探针,并固定于微小的载体表面,通过分子间的特异性反应,检测另一方的有无、多少或结构的改变等。主要包括 DNA芯片、蛋白质芯片、缩微芯片等。在肿瘤基因组学研究中,基因表达谱芯片可用于检测肿瘤组织和正常组织基因表达的差异,寻找癌症的诊断标志物及治疗靶标。近来出现了悬浮阵列技术,这是一种多功能的生物芯片平台,有机地整合了编码微珠、激光技术、应用流体学、高速数字信号处理器和计算机运算法则,造就了其检测的高特异性和高敏感度,可广泛应用于 DNA杂交、免疫分析、基因及蛋白质表达谱分子检测等多个研究领

域,也是目前惟一被美国药品与食品管理局批准用于临床诊断的生物芯片平台。柯峰等[11]以悬浮阵列技术检测 73例乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞,指出悬浮阵列方法在乳腺癌的预后判断方面具有实用价值。

近年来建立的细胞搜索系统是将磁性细胞分选技术、荧光抗体染色和半自动荧光显微镜分析方法结合的一种检测方法,敏感性高且已经建立了结果比较稳定的过程:用专用的试管保存标本,有专门的半自动样品制备盒和上皮细胞试剂盒用于富集表达特异标记的细胞,被富集的细胞用细胞核染料 DAPI染色,并用白细胞特异抗体标记 CD45进行阴性选择和上皮特异抗体(CK等)染色进行阳性选择,从而分离出肿瘤上皮细胞(CK阳性、CD45阴性的有核细胞);后用半自动荧光显微镜检查法检测并重建图像供分析[12]。细胞搜索系统检测 CTCs的效果已被许多学者验证:Allard等[13]选取了 9例转移性恶性肿瘤患者(包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及其他恶性肿瘤)和 199例非恶性肿瘤患者以及 145例健康人,应用细胞搜索系统计数 7.5m L外周血中的CTCs,结果发现 CTCs广泛存在于在恶性肿瘤患者中,但在非恶性肿瘤患者和健康人群中几乎检测不到 CTCs。Hiraiwa等[14]应用细胞搜索系统对 130例消化道肿瘤患者和 41例健康志愿者进行了分析,结果转移性肿瘤患者的 CTCs计数显著高于无转移组和健康对照组,指出消化道肿瘤 CTCs检测对于判断分期、预测腹膜转移和预后、评价治疗效果都是有意义的。尤其在乳腺癌的研究中,细胞搜索系统在肿瘤生物学特性、预后分析和疗效评估上都取得了良好的效果。Van der Auwera等[15]应用细胞搜索系统计数了乳腺癌患者的 CTCs,并同时检测了这些患者外周血的甲基化 DNA,指出 CTCs和甲基化 DNA数目都代表了较强侵袭性的肿瘤生物学特性,且 CTCs可能是外周血肿瘤特异性 DNA的来源。Yagata等[16]的研究发现良性乳腺肿瘤患者、无转移的乳腺癌和转移性乳腺癌患者间 CTCs的检出率有显著差异,且 7.5m L外周血中 CTCs数目≥5个的患者其预后较少于 5个的差,指出 CTCs计数不仅可以精确预测转

移,也是预后的预测因子。Nakamura等[17]选取了 118例转移性乳腺癌患者,分别于治疗前(作为基线水平)和一轮治疗后 12周应用细胞搜索系统检测CTCs数目,结果发现 CTCs数目能比影响学检查更早的反映治疗效果。Gates等[18]和 Stojadinovic等[19]的研究都表明,应用细胞搜索系统对乳腺癌患者进行 CTCs计数能够判定疗效,从而用于乳腺癌疫苗的研究。

细胞搜索系统正是磁性细胞分选技术和免疫细胞化学技术的有机结合,即纳米免疫磁珠富集检测法,不仅可以用于评估预后和治疗效果,还可进行细胞分选以实现进一步的研究。Swennenhuis等[20]和Leversha等[21]应用细胞搜索系统对前列腺癌患者的CTCs进行分选后对这些 CTCs进行了荧光原位杂交分析,指出应用细胞搜索系统分选后分析 CTCs的遗传性特性是可行的。Payne等[22]应用细胞搜索系统分选出乳腺癌患者的 CTCs,精确分析了 CTCs表面的表皮生长因子受体 EGFR表达,通过免疫印迹法进行验证后指出细胞搜索系统可以用于抗表皮生长因子受体靶向治疗患者的筛选。

CTCs的检测及评估有助于理解肿瘤转移机制、指导肿瘤治疗、为推断预后提供可靠参考、判断治疗效果、监测肿瘤的转移或复发,是一种具有高度可行性的、信息含量高的新型诊断手段,可在大规模、前瞻性和相似患者人群组中进行研究。

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