・ ３（）ｄ（） ・ 国际检验医学杂志２０１３年ｌ１月第３４卷第２２期ｌｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２２ ・综 述・ 环介导等温扩增技术用于疱疹病毒和黄病毒等检测的研究现状 李文桂△综述 （重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆４０００ｌ６） 关键词：环介导等温扩增技术； 疱疹病毒； 黄病毒 ＤＯＩ：ｌ０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１ ６７３—４１３Ｏ．２Ｏ１３．２２．０４５ 文献标识码：Ａ 文章编号：ｌ６７３ ４ｌ３０ Ｌ２０ｌ３）２２ ３０４０—０３ 疱疹病毒和黄病毒是多种病毒性疾病的病原体。２０００ 年，口本科学家Ｎｏｔｏｍｉ等 首先提出＿ｒ环介导等温扩增技术 （Ｉ ＡＭＰ），利用一种具有链置换反应的ＤＮＡ聚合酶和２对特 殊弓ｉ物，对靶序列上的６个特异序列进行特异扩增，在６５℃的 间通过杂交形成茎环结构．另外一条内部引物与其互补链退火 杂交后引导链置换合成反应，在扩增的ＤＮＡ片段的另一端产 生了新的茎环结构，形成哑铃结构。其次任ＬＡＭＰ循环扩增 阶段，这种哑铃状结构的ＤＮＡ为循环反应提供原料，哑铃结 构的ＤＮＡ通过自我引导延伸，生成双链茎环结构，该结构为 循环反应的起始结构。最后在延伸和再循环阶段，由十内引物 等温条件下反应１ ｈ即可将靶序列ＤＮＡ扩增１ｏ ～１０ 。。倍，产 生肉眼町见的白色焦磷酸镁沉淀，具有敏感性高、特异性强、简 便、快速和结果易于鉴定等优点。随后，国内外学者迅速开展 『Ｉ＿．ＡＭＰ技术检测疱疹病毒和黄病毒等的研究，本文拟就这 厅向的进展进行综述。 １ Ｉ ＡＭＰ技术原理 杂交在茎环的环上，引物链置换合成的ＤＮＡ产生 个有缺ｕ 的茎环ＤＮＡ中问媒介，在茎上附有目标序列，在茎的末端通 过外引物形成环状结构。由十内引物引导链置换延伸反应，茎 环个数逐渐增加，最后扩增产物是一系列反向重复的靶序列构 成的茎环结构和多环花椰菜结构的ＤＮＡ片段混合物。 １．４产物检测 １．４．１ 琼脂糖凝胶电泳 Ｉ．ＡＭＰ产物是小 ＤＮＡ片段的混 合物，琼脂糖凝胶电泳后呈现特异的梯状条带，经性内切 酶酶切后可出现单一的靶序列条带。 １．４．２浊度检测 Ｍｏｒｉ等”发现【．ＡＭＰ反应在合成ＤＮＡ 时，从ｄＮＴＰ析出的焦磷酸根离子（Ｐ （） 。）呵与反应液中的 １．１ 引物设计 Ｎｏｔｏｍｉ等…选择ｌ段２００ ｂｐ左右的靶基因 保守区域，针对该区的６个特异序列（３ 端的Ｆ３Ｃ、Ｆ２Ｃ和Ｆ１Ｃ 以及５ 端的Ｂｌ、Ｂ２和Ｂ３区）设训 ４条引物，即上游内部引物 （Ｆ１Ｐ）、ｉｖ游内部引物（ＢＩＰ）、上游外部引物（Ｆ３）和下游外部引 物（Ｂ３）。引物设计时要保持引物的退火温度为５５～６５℃，Ｆ２ ｊ Ｂ２之间相距１ ２Ｏ～１８Ｏ ｂｐ，Ｆ２与Ｆ３以及Ｂ２与Ｂ３之间相距 Ｏ～２（）ｂｐ．Ｆ２与Ｆ１以及Ｂ２与Ｂ１之间相距４Ｏ～６０ ｂｐ，从而避 免引物之问形成＿＿级结构。其中ＦＩＰ包含Ｆ１Ｃ—Ｆ２，它利用 ＦＩＣ Ｉ｜Ｊ Ｆ１互补自动成环进行正向扩增，ＢＩＰ包含Ｂ１Ｃ—Ｂ２，它 利用Ｂ１（、 Ｂ１互补自动成环进行反向扩增。Ｆ３和Ｂ３在Ｂｓｔ Ｉ）ＮＡ聚合酶的作用下可分别置换Ｆ１Ｃ—Ｆ２引导合成的止向链 Ｍｇ 结合，产生大量白色的焦磷酸镁沉淀，该沉淀具有高度的 特异性，扩增完成后肉眼观察反血管底的白色沉淀即可判断是 否扩增。当模板ＤＮＡ为２ ｌ０ ｃｏｐｙ（０．０１ Ｐｇ／ｔｕｂｅ）至２×１０ 以及Ｂｌ Ｂ２引导合成的反向链。Ｂｓｔ Ｉ）ＮＡ聚合酶在６Ｏ～６５ Ｃ时具有解旋功能和瀑布式扩增功能，在等温条件下即可实观 ｃｏｐｙ（０．０１ ｎｇ／ｔｕｂｅ）时，浊度与台成的Ｉ）ＮＡ呈线性关系，可达 钊埘合成的ＤＮＡ进行实时定量检测的ＬＩ的。 １．４．３荧光检测 可ｊＪ口用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、钙黄绿索和羟基萘 酚蓝（ＨＮＢ）等试剂进行检测。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ是一种荧光染 核酸亨厂增。为ｒ提高扩增效率，Ｎａｇａｍｉｎｅ等 在ＦＩＣ和Ｆ２ 之间增加＿ｒ上游环状引物（Ｆ１ Ｐ），在Ｂ１Ｃ和Ｂ２之间增加ｒ下 游环状引物（ＢＩ Ｐ）。ＦＩ Ｐ和ＢＩ Ｐ既可与内引物杂交，也可与 茎环杂交。从而加快反应速度，缩短反应时间，在３Ｏ～４５ ｍｉｎ 即叮实现目的基因的扩增。 料，它与ＤＮＡ结合后，颜色由橘黄色变为绿色，肉眼即可观 察。钙黄绿素是一种螯合齐４，可与试剂中的Ｍｎ 结合处于淬 灭状态。当Ｉ ＡＭＰ反垃的副产‘物Ｐ （） ＭＩ１ 结合后可使 １．２模板 Ｎａｇａｍｉｎｅ等 发现变性或非变性的ＤＮＡ模板均 口Ｊ介导良好的Ｉ ＡＭＰ反应，提示Ｉ ＡＭＰ反应叮不需要变性的 钙黄绿素释放，使其淬灭状念解除，从而发出黄绿色荧光，肉眼 即可观察。羟基萘酚瞌Ｌ ＨＮＢ）是一种Ｍｇ ’指示剂，由于 Ｉ ＡＭＰ反应的副产物Ｐ 【） 与Ｍｇ 形成夫量焦磷酸镁沉 Ｉ）ＮＡ作为模板；进 步研究表明变性ＤＮＡ的扩增效率比非 变性ＤＮＡ高出ｌＯ～１。（Ｊ倍，表明用变性ＤＮＡ进行ＬＡＭＰ反 应的敏感性要高于非变性ＤＮＡ。ＲＮＡ通过逆转录合成ｃＤ ＮＡ，该ｃ１）ＮＡ也可作为Ｉ ＡＭＰ的模板，因而可将逆转录 ｌ ＡＭＰ结合起来进行ＲＴ Ｉ ＡＭＰ反应。 淀，大量消耗Ｍｇ ， 『『『１反应结束后颜色发生变化，颜色显为 蓝色的为阳性反应．而颜色显为紫色的为阴性反应。由于 ＨＮＢ足反应前加入．反应结束后尢需开盖，町夫人减少反应后 的交叉污染。 ２疱疹病毒Ｉ ＡＭＰ检测 ２．１单纯疱疹病毒２型ｔＨＳＶ一２）ＨＳＶ ２是生殖器疱疹和 新生儿疱疹的主要病原体。Ｋａｎｅｋｏ等 ’针对该病毒的ＵＳ４ １．３ 反应过程 Ｉ．ＡＭＰ反应过程包括哑铃状模板合成阶段、 循环扩增阶段以及伸长和再循环３个阶段。首先由外部引物 扩增出内部引物扩增所需的模板，然后由内部引物引导合成靶 基 Ｉ）ＮＡ片段。由于内部引物扩增的ＤＮＡ片段含有与该引 物５ 端Ｉ）ＮＡ片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之 序列设计３对引物进行Ｉ ＡＭｔ’，发现５Ｏ例ＨＳＶ一２反应管为阳 作者简介：李义桂，男，博Ｉ．研究员．主要从事病 ＊ 幕金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８０１０５２、３０６７１８３５、３０５００４２３、３０２００２３９）。 原微 物的分 生物学和分子免疫学研究。 通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｃｑｌｉｗｅｎｇｕｉ＠１６３．｛２０１＂１１ 国际检验医学杂志２０１３年１１月第３４卷第２２期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２２ ・３０４１・ 性；其检测该病毒的敏感性为１０ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ，而ＰＣＲ为１∞ 相关。Ｋｕｈａｒａ等［１ ］针对该病毒的ＯＲＦ２６序列设计３对引物 ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于３Ｏ例生殖器疱疹患者的样本检测，发现 进行ＬＡＭＰ，发现ＨＨＶ一８反应管为阳性，而ＨＳＶ－１、ＨＳＶ一２、 其阳性率为４３．３ （１３／３０），与ＰＣＲ相当。Ｅｎｏｍｏｔｏ等口］针对 ＶｚＶ和ＥＢＶ对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为１００ ｃｏｐ 该病毒的糖蛋白Ｇ（ｇＧ）编码基因设计了３对引物进行 ｙ／ｔｕｂｅ；将其用于１９例卡波氏肉瘤组织的检测，发现其阳性率 ＬＡＭＰ，发现ＨＳＶ一２反应管为阳性，而ＨｃＭＶ、ＨＨＶ一６Ｂ、 为８４．２ （１６／１９），与实时ＰＣＲ相当。 ＨＨ￣Ｌ７和ＶｚＶ对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为１００ ３黄病毒ＬＡＭＰ检测 ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于５例生殖器疱疹患者样本的检测，发现其 ３．１ 日本脑炎病毒（ＪＥＶ） ＪＥＶ是流行性乙型脑炎的病原 阳性率为１００ （５／５）。Ｓｕｇｉｙａｍａ等［８＿用ｇＧ－Ｉ ＡＭＰ检测５Ｏ 体。Ｔｏｒｉｎｉｗａ等［１ 针对该病毒的ｅｎｖ基因序列设计３对引物 例生殖器疱疹患者的样本，发现其阳性率为２８ （１４／５０），而 进行ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ，发现ＪＥＶ反应管为阳性，而西尼罗河病毒和 病毒分离和实时ＰＣＲ分别为２４ （１２／５０）和３６ （１８／５０）。 登革病毒对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为１ ＰＦＵ／ｔｕｂｅ， 周支香等 利用ｇＧ－ＬＡＭＰ检测发现ＨＳＶ一２反应管为阳性， 与ＰＣＲ相当。Ｐａｒｉｄａ等ｌ１ 同样针对该病毒的ｅｎｖ基因序列设 而无菌水对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为０．０１ ｎｇ／ｔｔＩ 。 计３对引物进行ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ，发现ＪＥＶ反应管为阳性，而西尼 ２．２带状疱疹病毒（ＶｚＶ） ＶｚＶ是水痘和带状疱疹的病原 罗河病毒、登革病毒和圣路易斯脑炎病毒对照为阴性；其检测 体。Ｏｋａｍｏｔｏ等 针对该病毒的ＯＲＦ６２基因设计３对引物 该病毒的敏感性为０．１ ＰＦＵ／ｔｕｂｅ，而ＲＴ—ＰＣＲ为１Ｏ ＰＦＵ／ 进行ＬＡＭＰ，发现ＶｚＶ反应管为阳性，而ＨＳＶ一１、ＨＳＶ－２、 ｔｕｂｅ；将其用于６Ｏ例患者脑脊液标本的检测，发现其阳性率为 ＨＨＶ一６、ＨＨ一７和ＨＣＭＶ对照为阴性；其检测该病毒的敏感 ２２ （１３／６０），而ＲＴ—ＰＣＲ和病毒分离分别为７ （４／６０）和 性为５Ｏ０～１ ０００ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于３２份患者的标本检测， １２ （７／６０）。杜鹃等［２ｏ］针对该病毒的结构基因设计３对引物 发现其阳性率为５９．４ （１９／３２），而实时ＰＣＲ为７１．９ （２３／ 进行ＲＴ—ＬＡＭＰ，发现ＪＥＶ反应管为阳性，而猪细小病毒、猪 ３２）。 圆环病毒、伪狂犬病毒和猪瘟病毒对照为阴性；其检测该病毒 ２．３ ＥＢ病毒 ＥＢ病毒是传染性单核细胞增多症和多克隆Ｂ 的敏感性为１０。ＴＣＩＤ５。，而ＲＴ—ＰＣＲ为１０ ＴＣＩＤ 。；将其用于８ 淋巴细胞淋巴瘤的病原体。１ｗａｔａ等¨１ 针对该病毒的ｗ基因 份人工感染ＪＥＶ的鼠脑组织的检测，发现其阳性率为１００ 设计了３对引物进行Ｉ ＡＭＰ，发现ＥＢ病毒反应管为阳性，而 （８／８）。 ＨＳＶ １、ＨＳＶ一２、ＶＺＶ、ＣＭＶ和ＨＨＶ－８对照为阴性；其检测的 ３．２登革病毒 登革病毒是登革热的病原体。Ｐａｒｉｄａ等 １］ 敏感性为５ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于１０８例ＥＢ感染患者血清标本 针对该病毒的３ 端非编码区设计３对引物进行ＲＴ—ＰＣＲ，发现 和５１例喉拭子的标本检测，发现其阳性率分别为３５．２ （３８／ 登革病毒反应管为阳性，而Ｅｔ本脑炎病毒、西尼罗病毒和圣路 １０８）和２９．４ （１５／５１），与实时ＰＣＲ相当。 易斯脑炎病毒对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为０．１～１ ２．４巨细胞病毒（ＣＭＶ） ＣＭＶ感染非常广泛，常呈隐性感 ＰＦＵ／ｔｕｂｅ，比ＲＴ～ＰＣＲ敏感１Ｏ～１００倍；将其用于３８例疑似 染，好发于免疫功能受损或免疫功能缺陷等人群。Ｓｕｚｕｋｉ 患者的血清检测，发现其阳性率为１５．８ （６／３８），而Ｒ＇Ｉ、－ＰＣＲ 等ｌｌ ］针对该病毒的糖蛋白Ｂ编码基因设计２对引物进行 为５．３％（２／３８）。 Ｉ ＡＭＰ，发现ＣＭＶ反应管为阳性，而ＨＳＶ一１／２、ＨＨＶ一６／７和 ３．３西尼罗病毒西尼罗病毒是一种蚊传病毒，可引起人类 ＶｚＶ对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为５００ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将 和鸟类感染。Ｐａｒｉｄａ等ｌ＿２ 针对该病毒的包膜蛋白编码基因设 其用于１８Ｏ例患者标本的检测，发现其阳性率为８０．０ （１４４／ 计３对引物进行ＲＴ—ＬＡＭＰ，发现西尼罗病毒ＮＹ ９９株和Ｅｇ １８０）。Ｒｅｄｄｙ等ｌｌ１ ３＿用ｇＢ－ＬＡＭＰ检测发现ＣＭＶ反应管为阳 １０１株反应管为阳性，而日本脑炎病毒、登革病毒和圣路易斯 性，而ＶｚＶ和腺病毒对照为阴性；将其用于４Ｏ个病毒性视网 脑炎病毒对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为０．１ ＰＦＵ／ 膜炎患者的玻璃体样本检测，发现其阳性率为２５ （１０／４０）， ｔｕｂｅ，比ＲＴ ＰＣＲ敏感１０倍。 与实时ＰＣＲ相当。 ４其他病毒ＬＡＭＰ检测 ２．５人疱疹病毒６和７型 人疱疹病毒６和７型（ＨＨＶ一６／７） ４．１人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）ＨＰＶ与宫颈癌和生殖器感染 是幼儿急疹的病原体，进一步研究表明ＨＨＶ一６Ａ与多发性硬 密切相关，其中低危型ＨＰＶ一６与生殖器感染相关，而高危型 化有关，而ＨＨＶ－６Ｂ与幼儿急疹相关。Ｙｏｓｈｉｋａｗａ等＿】 针对 ＨＰＶ一１６和ＨＰＶ－１８与宫颈癌相关。Ｈａｇｉｗａｒａ等ｌ＿２ 分别针对 该病毒的Ｕ３８基因设计３对引物进行ＬＡＭＰ，发现ＨＨＶ一７反 ＨＰＶ一６、ＨＰＶ－１１和ＨＰｖ＿１８的Ｅ６区以及ＨＰＶ一１６的Ｅ７区设 应管为阳性，而ＨＨＶ一６Ａ、ＨＨＶ一６Ｂ和ＨＣＭＶ对照为阴性。 计２对引物进行ＬＡＭＰ，发现ＨＰＶ ６、ＨＰＶ一１１、ＨＰＶ一１６和 其检测该病毒的敏感性为２５０ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于２例幼儿 ＨＰＶ－１８反应管均为阳性；其检测这些病毒的敏感性均为１００ 急疹患者的标本检测，发现急性期血清（１ ｄ）为阳性，而恢复期 ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于２７例患者的标本检测，发现其阳性率为 血清（１３～１６ ｄ）为阴性。Ｉｈｉｒａ等＿ｌ 蚓针对该病毒的Ｕ３１基因 ８１．５ （２２／２７），而ＰＣＲ为７７．８ （２１／２７）。芦春斌等 同样 设计３对引物进行ＬＡＭＰ，发现ＨＨＶ一６反应管为阳性，而 针对ＨＰＶ一６的Ｅ６基因以及ＨＰＶ一１６的Ｅ７基因设计２对引 ＨＨＶ＿７和ＨＣＭＶ对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为２５ 物进行ＲＴ—ＬＡＭＰ，发现ＨＰＶ一６和ＨＰＶ一１６反应管为阳性，而 ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于１３例ＨＨＶ一６患者的血清检测，发现急性 ＨＰＶ－１１、ＨＰＶ一１８和ＨＰＶ－３１对照为阴性；其检测这些病毒的 期（１～３ ｄ）血浆的阳性率为６１．５ （８／１３），而恢复期血浆（５～ 敏感性为１ ０００ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ，而实时ＲＴ—ＰＣＲ为１００ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ； １０ ｄ）为ｏ．ｏ 。随后他针对ＨＨＶ一６Ｂ的Ｕ３１基因设计３对引 将其用于６２份宫颈刮片组织的检测，发现ＨＰＶ一６和ＨＰＶ一】６ 物进行ＬＡＭＰ，发现ＨＨＶ一６Ｂ反应管为阳性，而ＨＨＶ－６Ａ对 的阳性率分别为２１．０ （１３／６２）和２９．０ （１８／６２），与凯普 照为阴性；其检测２ｏ例幼儿急疹患者血清的阳性率为１００ 。 ＨＰＶ分型法相一致。 ２．６人疱疹病毒８型（ＨＨＶ一８）ＨＨＶ－８与卡波氏肉瘤密切 ４．２人类免疫缺陷病毒１ 人类免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）是 ・３０４２・ 国际检验医学杂志２０１３年ｎ月第３４卷第２２期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２２ 获得性免疫缺陷综合征的病原体。Ｃｕｒｔｉｓ等 针对该病毒的 蛋白酶编码基因和Ｐ２４蛋白编码基因分别设计３对引物进行 ＲＴ—ＬＡＭＰ，发现ＨＩＶ一１反应管为阳性，而ＨＩＶ一２对照为阴 性；蛋白酶一ＲＴ—ｌ ＡＭＰ和Ｐ２４一ＲＴ－ＩＡＭＰ检测该病毒的敏感 性分别为１００ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ和１０ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ；将其用于５个ＨＩＶ一１ 患者的血清检测，发现其阳性率为８ｏ （４／５）。 ４．３埃博拉病毒 埃博拉病毒是致病性出血热的病原体。 Ｋｕｒｏｓａｋｉ等口。 针对该病毒的５ 非编码区设计２对引物进行 ＲＴ Ｉ ＡＭＰ，发现２株扎伊尔埃博拉病毒反应管为阳性。而３种 其他埃博拉病毒对照为阴性；其检测该病毒的敏感性为２ｏ ｃｏｐｙ／ｔｕｂｅ。 ５ 结 语 将ＬＡＭＰ技术用于疱疹病毒和黄病毒等的检测具有特异 性强、灵敏度高、结果易于鉴定、操作便利、适宜在基层推广等 优点。筛选物引物工作量大，易出现假阳性，不能进行克隆、测 序和表达，不能进行长链ＤＮＡ扩增等。但随着Ｉ．ＡＭＰ技术的 不断完善，将其用于疱疹病毒和黄病毒等的临床检测具有广阔 的应用前景。 参考文献 ［１－Ｎｏｔｏｍｉ＿ｒ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，２０００，２８ （１２）：Ｅ６３． ２］ Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ，Ｈａｓｅ Ｔ。Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ ｍｅ ｄｉａｌｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｕ １ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，２００２，ｌ ６（２）：２２３ ２２９． ［３］ Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｔｄｕｋａ Ｋ，ｅｔ ａ１．１Ｊｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００１，４７（９）：１ ７４２ １７４３． ［４］ Ｍｏｒｔ Ｙ，Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ， Ｆｏｍｉｔａ Ｎ。ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎａｇｎｅ ｓｌｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ ｍｕｎ，２００１，２８９（１）：１５０ １ ５４． ｒ５］Ｍｏｒｉ Ｙ，Ｋｉｔａｏ Ｍ， Ｉ＇ｏｍｉｔａ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｉ．ＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉ｛ｙｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ［３］．Ｊ Ｐ，ｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏ ｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，５９（１）：ｌ４５ １ ５７． ｒ６ １ Ｋａｎｅｋｏ Ｈ，ｌｉｄａ Ｔ．Ａｏｋｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｖａｒｉｃｅｌｌａ——ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｂｙ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉ ｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（７）：３２９０ ３２９６． ｒ７］Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ，Ｉｈｉｒａ Ｍ。ｅｌ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈｅｒ ｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ——ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎａｐｌｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（２）：９５卜９，５５． ｒ８］Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ，Ｉｈｉｒａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ ｎｌｅ ￣ｆｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｇｅｎｉｔａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００５，７５（３）：５８３ ５８７． ｒ９］周文晋，姜华，王际平，等．ＬＡＭＰ技术检测单纯疱疹病毒２型的 初步应用［Ｊ］．南华大学学报：医学版，２０１０，３８（２）：１８Ｏ ｌ８２． ｒ１０ｊ Ｏｋａｍｏｔｏ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ，ｌｈｉｒａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｒｉ ｃｅｌｉａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００４，７４（４）：６７７～６８２． ［１１］１ｗａｔａ Ｓ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｙ，Ｋａｗａｄａ Ｊ，ｅｌ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｂｙ ｌｏｏｐ。。ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔ ｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈ ｏｄ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２００６，３７（１）：１２８ ｌ ３３． 口２］Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ。Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ，ｌｈｉｒａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｏｐ— ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２（）０６，Ｉ３２（２）：２１ ６ ２２１． ［１ ３］Ｒｅｄｄｙ ＡＫ，Ｂａｌｎｅ ＰＫ，Ｒｅｄｄｙ ＰＫ，ｅｔ ａ１．１）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ｛＇￣ｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉ）ＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｓｐｅｅｉ ｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃａｓｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ＿Ｊ１．．１ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｕｌ， ２Ｏ１０，４８（６）：２０５０ ２０５２． ｒ Ｊ４１ Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｆ，Ｉｈｉｒａ Ｍ，Ａｋｉｍｏｔｏ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＤｅｔｅｃＵｏｎ ｏｆ ＨｕｌＴｌａｎ ｈｅｒ ｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ７ ＤＮＡ ｂｙ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［门． ｉ （ ｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，４２（３）：１ ３４８ Ｊ ３５２． ［１５］ｌｈｉｒａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｒｒ，Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈ ｍａｌｌ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ６ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ １）ＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｂ ｏｄ，ｌｏｏｐ・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．１ Ｃｌｉｎ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ。 ２００４，４２（１）：１４０ １ ４５． ［１６］ｌｈｉｒａ Ｍ，Ｏｂｔａ Ａ，Ｓｕｇａｔａ Ｋ．ｅｔ ａ１．１ｘ）ｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｂｅｔｗｅ｛＿ｆ１ Ｈｕ，ｎａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ６人ａｎｄ Ｂ ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ。２００８，１ ５４（２）：２２３ ２２５． ［１ ７］Ｋｕｈａｒａ Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ，ｌｈｉｒａ Ｍ．ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ８ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ［Ｊｒ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ｛｝ｄｓ，２００７，１４４（１）：７９ ８５． ［１８］Ｔｏｒｉｎｉｗａ Ｈ，Ｋｏｍｉｙａ Ｔ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊａ ａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ口］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６． ５０（５）：３７９－３８７． ［１９］Ｐａｒｉｄａ ＭＭ，Ｓａｎｔｈｏｓｈ ＳＲ，Ｄａｓｈ ＰＫ，ｅｔ ａ１．１）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｗｄｕ ａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｊａｐａｎｃｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉ ｅｒｏｂｉｏｌ，２００６，４４（１１）：４１７２ ４ｌ７８． ［２Ｏ］杜鹃，宋永，刘立科，等．流行性乙型病毒・步法ＲＴ Ｉ ＡＭＰ检测 方法的建立［Ｊ］．中国预防兽医学报，２Ｏｌｏ，３２（１０）：７７３ ７７６． Ｌ２ １］Ｐａｒｉｄａ Ｍ，Ｈｏｒｉｏｋｅ Ｋ，Ｉｓｈｉｄａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｂｙ ａ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｒｅｖｅ ｒｓｅ ｔ ｒａｎ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［Ｊ ｊ．Ｊ（＇ｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（６）：２８９５ ２９０３． ｒ２２］Ｐａｒｉｄａ Ｍ．Ｐｏｓａｄａｓ（ ，Ｉｎｏｕｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ ｌｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ ｔｉｏｎ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，４ ２‘１）：２５７ ２６３． ｒ２３］Ｈａｇｉｗａｒａ Ｍ，Ｓａｓａｋｉ Ｈ，Ｍａｔｓｕｏ Ｋ。ｅｔ ａ１．Ｉ，ｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｌｉｎ／ａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ６。１１，１６ ａｎｄ ｌ８［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２（）０７，７９（４）：６０５ ６Ｉ ５． ［２４］芦春斌，罗乐，杨梦婕，等．基于颜色判定的环介导等温扩增技术 检测ＨＰＶ一６和ＨＰＶ１ ６［Ｊ］．病毒学报 ２ｏ１１，２７（１）：６４ ７０． ［２Ｓ１．】Ｃｕｒｔｉｓ ＫＡ，Ｒｕｄｏｌｌｐｈ Ｄ１ ，Ｏｗｅｎ ＳＭ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ｌ｝）ｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｎｔｈｅｒｎｍｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒ ｌ、 Ｉ．ＡＭＰ）［Ｊｒ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８，１ ５ｌ（２）：２６４ ２７０． ［２６］Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ｙ， Ｉ＇ａｋａｄａ Ａ，Ｅｂｉｈａｒａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｄｅｌｅｃ ｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊｒ．１ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，Ｍ １（１）：７８墙３． （收稿ｆ］期：２０１ ３ ０５ ３０）
