中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论
潘友文
（罗氏/基因泰克，美国南旧金山，94080）
2016年07月29日
摘要目的： 分析中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的之间的差异性，为评价不同药典中无菌检查法的等效性提供参考。方法： 对无菌检查法的主要实验步骤和参数进行一对一比较，对有差异的步骤和参数进行科学论证和评价。结果：中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的主要参数和步骤是一致的，但中国药典无菌检查法还需要做阳性对照和厌氧需氧菌的额外培养。并且，中国药典用大肠埃希菌代替美、欧、日药典中的铜绿假单胞菌参与无菌检查法的适用性试验。结论：各药典的无菌检查法是等效的。在不影响方法等效性的前提下，中国药典2015版无菌检查法在阳性对照和培养方法上还可以进一步简化。 关键词: 无菌检查法；中国药典；美国药典；欧洲药典；日本药典
Gap Assessment and Discussion on Sterility Tests in Chinese Pharmacopoeia 2015, United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia, and Japanese Pharmacopoeia
Youwen Pan (Genentech, a Member of Roche, South San Francisco, USA 94080)
Abstract Objective：Gap assessment and discussion on the sterility test methods in Chinese Pharmacopoeia 2015 edition (CP2015), United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), and Japanese Pharmacopoeia (JP). Method：The test procedures and key parameters in the sterility test methods in different pharmacopoeia were compared step by step and the differences were identified. The identified differences are scientifically evaluated for their impact to the equivalence of the methods. Result：The sterility test method in CP2015 is largely harmonized with that in USP, EP and JP except for a few differences. Positive control and extra incubation bacteria are required in CP2015 only, and Escherichia coli is used in method suitability test in CP2015 while Pseudomonas aeruginosa is used in USP/EP/JP. Conclusion：The Sterility Test Methods in CP2015, USP, EP, and JP are equivalent. The method in CP2015 could be simplified more without compromising the validity, accuracy and reliability of the method. Key words： sterility test；Chinese Pharmacopoeia 2015；United States Pharmacopoeia；European Pharmacopoeia； Japanese Pharmacopoeia
无菌检查法是用于检查药典规定的无菌物品是否被微生物污染的检测方法。无菌本身是一个绝对概念（即一个药品单元要么无菌、要么被污染），但又有其相对性，即一个药品单元是无菌的可能性（用概率表示）。根据微生物的污染的不确定性和其遵循对数死亡规律，各国药典均规定最终灭菌后无菌药品的非无菌品的概率（污染率）应不得高于一百万分之一。无菌检查是一项破坏性检
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验，有限的样品抽样量和培养条件使无菌检查结果无法判断批无菌药品是否符合上述无菌保证标准。因此，在药典的无菌检查章节开始即声明无菌结果合格仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。
尽管无菌检查法自1932年起实施以来经历了持续性改进和提高，但目前仍存在两大无法克服的缺陷：1）有限的取样量无法满足对批产品的无菌保证水平进行科学评价的统计学要求； 2）有限的培养条件无法使所有的潜在性污染微生物恢复生长。
为避免无菌检查结果在不同国家或地区出现差异性评价，世界主要发达国家的药典如美国药典（USP）【1】、欧洲药典（EP）【2】和日本药典（JP）【3】均已将无菌检查法统一化（以下简称“统一化方法”）。中国药典2015版（CP2015）【4】也将无菌检查法在2010版基础上作了重大修改，旨在与上述发达国家药典中的无菌检查法相统一。CP2015无菌检查法与统一化方法的一致性主要体现在：同品种类别的取样量和样品检验量相同、采用的试验方法（直接接种法和薄膜过滤法）相同、培养基配方及其适用性检查法相同、培养条件（温度和时间）相同。尽管如此，CP2015与美欧日药典中的统一化无菌检查法仍有稍许差异。这些差异主要包括：1）CP2015规定在进行常规的无菌检查时做阳性对照试验，而统一化方法不要求做阳性对照试验；2） 在做具体检测样品的方法适用性试验时，除了其它五种菌与统一化方法相同外，CP2015规定用大肠埃希菌 (Escherichia coli)代替统一化方法中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa )； 3）对生物制品作无菌检查时，CP2015特别要求将硫乙醇酸盐流体培养基分为两等份，一份在30-35℃下培养，另一份则在20-25℃下培养，而统一化方法没有对生物制品的无菌检查有特别要求。本文将分析这三项主要差异，并评估和讨论CP2015无菌检查法与统一化方法的等效性。
阳性对照在无菌检查试验中正面意义有限
目前药典规定的无菌检查法是一项经典性试验。为了保证供试品本身不会对无菌检查法产生抑菌性影响而导致假阴性结果，药典规定在对具体产品/样品进行无菌检查前，须采用实际供试品进行
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方法适用性试验（即方法验证试验）。如同培养基的灵敏度检查，须采用至少六种不同试验菌株在低接种量下评估无菌检测方法的适用性。所采用的六种试验菌株涵盖了自然环境中最为常见的微生物种类，包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、产芽孢类细菌、厌氧菌、酵母菌和霉菌。除了采用药典规定的试验菌株外，生产企业通常会增加1株或2株生产设施中的分离菌，以确保无菌检查法对相关供试品的灵敏性和可信度。为考察无菌检查法的稳定性和可靠性，通常需要用三批供试品和至少两名不同检验人员分别进行方法适用性试验。当上述所有的试验菌株对每批供试品的适用性检验结果均合格后，无菌检查法方可通过验证。只有通过验证后，无菌检查法方可用于相应产品的批放行检查。如果产品组份、试验用材料或试验程序和条件发生变更，须经书面风险评估后决定是否需要对无菌检查法重新进行验证。
如果一个供试品的无菌检查法通过了适用性试验，证明该供试品在所建立的无菌检查试验条件下不会对潜在污染菌的恢复生长产生不良影响。CP2015 <1101>无菌检查法规定，在进行供试品的无菌检查时采用方法适用性试验中的其中一株试验菌做阳性对照，阳性对照试验结果用于评价供试品无菌检查试验结果是否有效的依据。虽然药典要求选择敏感菌株作为阳性对照，但该敏感菌株也必定参与并通过了方法适用性验证试验。采用单个菌株做阳性对照也只能接种于其中一种培养基，况且也无法全面反映培养基在有供试品的检验条件下对广谱微生物的促生长能力。与供试品无菌检查法的适用性试验结果相比，只要检查人员经过培训并遵守经验证过的试验规程进行供试品的无菌检验，采用单个试验菌株的阳性对照结果并不能给检查法的有效性和可信度提供任何额外性支持。更何况，无菌检查法中的阳性对照试验会给供试品的无菌检查造成诸多潜在的负面影响。
供试品无菌检查中的阳性对照可能会给无菌检验带来的困扰主要包括：1） 大大增加了检验工作量，因为试验菌株的菌悬液需要预先培养、制备和定量检查接种量； 2）阳性对照试验会额外增加小容量样品的取样量和检验用耗材；3）阳性对照试验会增加实验环境污染的风险。
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因此，只要所建立的供试品无菌检查法按药典规定通过了适用性试验并由受过良好训练的检验人员进行供试品检验，阳性对照试验除了增加诸多困扰外，对无菌检查试验结果的有效性评价没有太大的价值。
大肠埃希菌 (E. coli)不比铜绿假单胞菌（P. aeruginosa )在方法适用性检查中更具代表性
在无菌检查方法适用性试验中作为革兰氏阴性细菌的代表，CP2015采用大肠埃希菌 (E. coli)
[CMCC (B) 44102]典外，在国际食品、药品和化妆品的标准微生物检测方法中铜绿假单胞菌（，但在统一化方法中则采用铜绿假单胞菌（P. aeruginosaP. aeruginosa ) [ATCC 9027 ) []。除药ATCC
9027]总被作为革兰氏阴性细菌的代表用于方法验证试验 【5, 6, 7, 8】。与大肠埃希菌 (E. coli)相比，铜
绿假单胞菌（P. aeruginosa )或与其亲缘关系相近的细菌更加常见于水系统以及制药生产环境【9, 10】。
大肠埃希菌 (E. coli)主要存在于人和温血动物的小肠而非自然环境，除非自然环境受到粪便污染，并且一般也不会在自然环境中长时间存活【11】。与铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10104]相比，大肠埃希菌 (E. coli) [CMCC (B) 44102]可能会对某些抑菌剂更加敏感【12, 13】。但并非总是如此，在对其它一些滴眼剂的抑菌效力测试结果表明大肠埃希菌并不比铜绿假单胞菌更敏感【14, 15】。无论如何，在对
滴眼剂的抑菌效力测试中，两种菌之间的敏感性虽有差异，但并不显著（相同条件下的对数下降值差异不超过0.5个对数单位，或者最小抑制浓度未超过2倍稀释度）【12, 13, 14, 15】。 因此，
在无菌检查方法适用性试验中，作为革兰氏阴性细菌的代表，大肠埃希菌 (E. coli) [CMCC (B)
44102]并不比铜绿假单胞菌（P. aeruginosa ) [CMCC (B) 10104]更具代表性。
硫乙醇酸盐流体培养基在两种温度下同时培养并不能增加生物制品无菌检查的灵敏度
对非生物制品而言，CP2015<1101>无菌检查法中采用的培养基种类及培养条件与统一化方法相同。但是，CP2015对生物制品的无菌检查培养条件提出了特别要求，培养前，将硫乙醇酸盐流体培养基分成两等份后分别置于30-35℃和20-25℃培养14天。统一化方法对生物制品的无菌检查没有任何特别的培养条件要求。为了尽可能提高对污染微生物的检测能力，无菌检查试验采用两种
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培养基和两个培养温度来覆盖各类环境微生物或潜在性污染微生物的恢复生长。胰酪大豆胨液体培养基（Soybean-Casein Digest Medium）在20-25℃ 下适合于广泛的需氧菌、兼性厌氧菌和真菌（酵母菌和霉菌）的生长【16】。硫乙醇酸盐流体培养基（Fluid Thioglycollate Medium）在30-35℃ 下适合于中温性需氧菌和厌氧菌的生长【17】。研究表明，无论是中温性需氧菌还是厌氧菌，它们均适于在20 - 45℃范围内和生长，并且最佳生长温度是在32.5℃ 左右【18】。与一般化学药品相比，虽然生物制品的生产用原料和生产工艺程序更加复杂并且更加易于被微生物污染，但是污染微生物仍主要属于中温菌（Mesophiles）的范畴。即使有更加适合在20-25℃ 下生长的污染菌存在，如果是需氧菌，它会在胰酪大豆胨液体培养基中被发现；如果是厌氧菌，在足够长的培养时间（14天）下，它也能够在30-35℃ 下培养的硫乙醇酸盐流体培养基中生长并被发现【19】。
对直接接种法而言，如果将加有供试品的硫乙醇酸盐流体培养基分成两等份后，在20-25℃下并不符合中温细菌的最佳生长条件。对薄膜过滤法而言，则会增加取样量和检测量，但无论从统计学还是微生物生长特性来看，增加硫乙醇酸盐流体培养基在20-25℃下培养并不能提高无菌检查试验的灵敏度。
尽管CP2015无菌检查法在方法的可操作性和检测能力方面比2010版有了显著提高并且与美欧日药典统一化方法更趋于一致，但是仍有一些细微差别。通过分析和讨论这些细小差别可以发现，CP2015无菌检查法中的阳性对照、采用大肠埃希菌作为方法适用性试验中革兰氏阴性细菌的代表、以及对生物制品检查中分配硫乙醇酸盐流体培养基至20-25℃ 下培养，均不能赋予无菌检查法更高的检测能力和检测水平。实质上各药典的无菌检查法是等效的。在不影响方法等效性的前提下，中国药典2015版无菌检查法在阳性对照和培养方法上还可以进一步简化。 参考资料
[1]. USP38 —National Formulary 33. Chapter <71> Sterility Tests[S]. U.S. Pharmacopeial Convention: Rockville,
MD, 2015.
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[2]. European Pharmacopoeia 8.8. Chapter 2.6.1. Sterility[S]. The European Pharmacopoeia Commission:
Strasbourg, France, 2016. [3]. Japanese Pharmacopoeia 16th edition. Chapter 4.06 Sterility Test[S]. Pharmaceuticals and Medical Devices
Agency (PMDA). Tokyo, Japan. 2011. [4]. 中国药典[S].2015年版.四部. 136-140.
[5]. ISO 11133:2014. Microbiology of food, animal feed and water -- Preparation, production, storage and
performance testing of culture media[S]. International Organization for Standardization. Geneva, Switzerland. 2014. [6]. ISO 22149:2006, Cosmetics – Microbiology – Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria. International Organization for Standardization[S]. Geneva, Switzerland. 2006 [7]. ASTM E0-06, International Standard Test Method for Preservatives in Water-Containing Cosmetics[S]. ASTM International. West Conshohocken, PA. 2012. [8]. USP38 —National Formulary 33. Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Testing[S]. U.S. Pharmacopeial Convention: Rockville, MD. 2015 [9]. Sandle, T., A review of cleanroom microflora: types, trends, and patterns[J]. PDA J Pharm Sci Technol., 2011, 65:392–403. [10]. Penna, V.T., Martins, S.A. and Mazzola, P.G., Identification of bacteria in drinking and purified water during the monitoring of a typical water purification system[J]. BMC Public Health, 2002, 15:13–16. [11]. Russell JB and Jarvis GN. Practical mechanisms for interrupting the oral-fecal lifecycle of Escherichia
coli[J]. J. Mol. Microbio. Biotechnol. 2001(3): 265–272. [12]. 江志杰，高春. 玻璃酸钠滴眼液抑菌效力的评价[J]. 中国现代应用药学， 2013，30( 7): 788-792. [13]. 丁勃，巩丽萍，谢元超. 阿奇霉素滴眼液抑菌剂筛选与抑菌效力研究[J]. 中国药品标准，2012，13( 4):
281-284. [14]. 肖璜，林吉恒，陈万胜，等. 氯霉素滴眼液中尼泊金乙酯含量合理性的探讨[J]. 中国药师, 2014, 17(5):
785-788. [15]. 江志杰，李玉立，刘文杰. 吡诺克辛滴眼液的抑菌效力评价[J]. 中国现代应用药学， 2015，32( 6):
704-708. [16]. Zimbro, M. J. and D. A. Power., Soybean-Casein Digest Medium in Difco™& BBL™ Manual of Microbiological Culture Media[M], Becton, Dickinson and Company, 2003, 588-591. [17]. Zimbro, M. J. and D. A. Power., Fluid Thioglycollate Medium in Difco™& BBL™ Manual of Microbiological Culture Media[M]. Becton, Dickinson and Company, 2003, 554-560. [18]. Willey, J.M., Sherwood, L.M. AND Woolverton, C.J. Prescott, Harley and Klein's Microbiology[M]. 9th
Edition. McGraw Hill Higher education. 2013. [19]. Bathgate H., Lazzari D., Cameron H., et al. The incubation period in sterility testing[J]. J. Parenter. Sci.
Technol., 1993, 47:254–257.
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