一种副干酪乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111909882 A(43)申请公布日 2020.11.10

(21)申请号 202010944015.9(22)申请日 2020.09.10(83)生物保藏信息

CGMCC NO.16941 2018.12.17

(71)申请人 青岛普罗百世生物科技有限公司地址 266700 山东省青岛市平度市经济开

发区经五路北侧、珠海路西侧(72)发明人 张佳　谭竹毅　

(74)专利代理机构 北京中索知识产权代理有限

公司 110

代理人 周国勇(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)A23K 10/18(2016.01)A23K 50/40(2016.01)

(54)发明名称

一种副干酪乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用(57)摘要

提供了本发明适用于微生物育种技术领域，

一株副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌PLBS001，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16941；本发明还提供了一株副干酪乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用。借此，本发明的副干酪乳杆菌PLBS001能够提高宠物犬的毛发美观性和观赏性；同时能够提高宠物犬的生产性能和机体免疫力，降低宠物犬的腹泻率和死亡率，有助于增加宠物犬养殖的经济效益。CN 111909882 A

C12R 1/225(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图3页

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权　利　要　求　书

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1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌PLBS001，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16941。

2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌取自牛乳。3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为200～1500mg/kg。

4.根据权利要求3所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为720～1120mg/kg。

5.一种筛选权利要求1所述的副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一混合菌株的稀释

将牛乳放入MRS固体培养基37℃培养24小时，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；

步骤二菌株的初筛分别取所述稀释液，涂布到添加有1.5～3％碳酸钙的MRS固体培养基上，于37℃培养箱中厌氧培养36～48h；选取有钙溶圈的单菌落，为初筛菌株；

步骤三菌株的复筛

分别将所述初筛菌株接入到MRS液体培养基中，继续培养24h，得到复筛菌株。6.根据权利要求5所述的筛选所述副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，所述MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L。

7.根据权利要求5所述的筛选所述副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述菌落的培养条件为37℃，200rpm。

8.一种根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用。

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说　明　书

一种副干酪乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用

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技术领域

[0001]本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种副干酪乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用。

背景技术

[0002]随着经济的发展，人们生活水平提高，宠物犬数量随之增加。宠物犬与人们建立了亲密的关系，不仅为人们提供安全感、陪伴，也在一定程度上缓解人们生活的压力所带来的负面影响，因此它们又被称为“伴侣动物”。宠物幼犬消化道发育并未完全，消化功能薄弱，胃肠蠕动能力较差，饲喂市场普通犬粮容易激发炎症反应，导致疾病的发生；同时，宠物犬的毛发美观性也受到影响，观赏性降低。

[0003]乳酸菌发酵饲料不仅会产生大量的乳酸菌和有机酸、酶等代谢产物，还可以降解饲料中的抗营养因子，能够改善饲料的适口性，提高饲料中营养物质的消化利用，从而改善动物的生长性能。[0004]副干酪乳杆菌是乳杆菌属中的重要种群之一，具有较强的产酸、耐酸和抑菌等特性，能阻止致病菌在肠道的生长和繁殖，同时副干酪乳杆菌还可产生天然的抗菌物质，对肠道致病菌有明显的抑制和杀灭作用。副干酪乳杆菌不仅对致病菌有拮抗作用，而且能粘附于肠道上皮细胞上，起到占位性保护作用。同时，副干酪乳杆菌还可产生非特异性免疫调节因子，刺激肠道局部免疫反应，提高犬的非特异性免疫功能。[0005]但是，副干酪乳杆菌在犬粮中的应用研究鲜有报道，其添加量及效果也不尽相同。[0006]综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。发明内容

[0007]针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用，在宠物犬日粮中添加适宜水平的副干酪乳杆菌PLBS001，能够提高宠物犬的被毛手感力度、柔顺度和光亮度，毛发美观性和观赏性都比较高；同时能够提高宠物犬对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高宠物犬的生产性能和机体免疫力，降低宠物犬的腹泻率和死亡率，有助于增加宠物犬养殖的经济效益。[0008]为了实现上述目的，本发明提供一株副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌PLBS001，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16941。[0009]根据本发明的副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌取自牛乳。[0010]根据本发明的副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为200～1500mg/kg。

[0011]根据本发明的副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为720～1120mg/kg。

[0012]根据本发明的副干酪乳杆菌，本发明还提供一种筛选所述副干酪乳杆菌的方法，

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包括以下步骤：[0013]步骤一 混合菌株的稀释

[0014]将牛乳放入MRS固体培养基37℃培养24小时，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；[0015]步骤二 菌株的初筛[0016]分别取所述稀释液，涂布到添加有1.5～3％碳酸钙的MRS固体培养基上，于37℃培养箱中厌氧培养36～48h；选取有钙溶圈的单菌落，为初筛菌株；[0017]步骤三 菌株的复筛

[0018]分别将所述初筛菌株接入到MRS液体培养基中，继续培养24h，得到复筛菌株。[0019]根据本发明筛选副干酪乳杆菌的方法，所述MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L。

[0020]根据本发明筛选副干酪乳杆菌的方法，所述步骤三中，所述菌落的培养条件为37℃，200rpm。

[0021]根据本发明的副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用。[0022]本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用，本发明提供的副干酪乳杆菌PLBS001，具有较强的耐酸性、耐胆盐和耐人工胃肠液的性能，在宠物犬日粮中添加适宜水平的副干酪乳杆菌PLBS001，能够提高宠物犬的被毛手感力度、柔顺度和光亮度，毛发美观性和观赏性都比较高；同时能够提高宠物犬对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高宠物犬的生产性能和机体免疫力，降低宠物犬的腹泻率和死亡率，有助于增加宠物犬养殖的经济效益。

附图说明

[0023]图1是本发明副干酪乳杆菌PLBS001的菌落形态图；[0024]图2是本发明副干酪乳杆菌PLBS001的生长曲线图；[0025]图3是本发明副干酪乳杆菌PLBS001的耐酸性试验图；[0026]图4是本发明副干酪乳杆菌PLBS001的耐胆盐试验图；

[0027]图5是本发明副干酪乳杆菌PLBS001的人工胃肠液耐受性试验图。

具体实施方式

[0028]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0029]本发明提供了一株副干酪乳杆菌，拉丁文学名：Lactobacillus paracasei；该副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌PLBS001，已于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.16941。

[0030]本发明的副干酪乳杆菌取自牛乳，本发明提供了副干酪乳杆菌PLBS001的筛选和

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鉴定方法，包括以下步骤：[0031]一菌株的筛选[0032]步骤一 混合菌株的稀释

[0033]将牛乳放入MRS固体培养基37℃培养24小时，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液。

[0034]MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L，115℃灭菌20分钟。[0035]步骤二 菌株的初筛[0036]分别取上述稀释液，涂布到添加有1.5～3％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，于37℃培养箱中厌氧培养36～48h；选取长势良好且有明显钙溶圈的单菌落，为初筛菌株。[0037]步骤三 菌株的复筛

[0038]分别将上述初筛菌株接入到MRS液体培养基中，37℃200rpm条件下，继续培养24h，得到复筛菌株。

[0039]二菌株的鉴定[0040]形态学鉴定[0041]根据《乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法》和《伯杰氏系统细菌学手册》，对复筛菌株进行菌落菌体形态学鉴定。(参见图1)[0042]由图1可知，菌落呈椭圆形或类圆形，边缘整齐，菌落大小一般为2～3mm，乳白色。[0043]基因序列鉴定

[0044]将复筛菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，根据得到的16S r DNA序列信息与NCBI的16S数据库进行比对，设置参数identify>95。然后选取identify最高的前30条16S r DNA序列(不足则全取)，并利用muscle软件进行序列多重比对后，采用FastTree软件构件系统发育树。结果显示，复筛菌株与已发表的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei CNCM1-2877最接近，基于16S r DNA序列构件的进化树也显示其与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei CNCM1-2877进化关系最为接近。因此，将复筛菌株归为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌PLBS001。[0045]为了验证本发明的副干酪乳杆菌PLBS001的菌株性质，本发明进行了菌株性质试验，包括菌株的生长曲线、耐酸性试验、耐胆盐试验和人工胃肠液耐受性试验。[0046]菌株的生长曲线

[0047]将活化好的副干酪乳杆菌PLBS001按1％(v/v)接种量接入MRS液体培养基中，37℃静置培养48h，每隔4h在600nm测定培养液的菌浓。得到菌株的生长曲线。(参见图2)[0048]由图2可知，副干酪乳杆菌PLBS001在MRS培养基中生长迅速，在6h左右进入对数期；随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，20h左右进入稳定期；44～48h菌量下降。

[0049]耐酸性试验

[0050]将副干酪乳杆菌PLBS001的菌悬液4℃离心5min，然后用PBS清洗3次菌泥，按3％的接种量接种于pH值为3.0的液体MRS培养基中，37℃培养，分别取0、1、2、3h时的菌液稀释涂布，以新鲜MRS培养基为空白对照，计算存活率。(参见图3)

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由图3可知，在pH值为3.0的MRS中生长3h后，副干酪乳杆菌PLBS001的存活率仍达

到30％以上，说明副干酪乳杆菌PLBS001对酸性环境有较强的耐受性。[0052]耐胆盐试验

[0053]按3％的接种量将副干酪乳杆菌PLBS001的菌悬液接种于胆酸盐浓度为0.3％的MRS液体培养基中，37℃培养0、1、2、3和4h时，分别取样品进10倍梯度稀释，取适当梯度的稀释液进行涂布计数，以新鲜MRS培养基为空白对照，计算存活率。(参见图4)[0054]由图4可知，副干酪乳杆菌PLBS001对胆盐具有很高的耐受性，在3h时菌株存活率还高于10％。

[0055]人工胃肠液耐受性试验[0056]副干酪乳杆菌PLBS001的菌悬液离心后用PBS清洗3次，将菌泥悬于经滤膜过滤除菌的人工胃液(0.35％胃蛋白酶、0.3％Na Cl、调整至pH为3.0)中，37℃分别培养0、1、2、3h时，取菌液稀释涂布，用平板菌落计数法计算活菌数，测定菌株在酸性胃液条件下的耐受性。

[0057]当菌体在人工胃液中处理3h后，吸取含菌人工胃液，加入至经滤膜过滤除菌的人工肠液(1.1％碳酸氢钠、0.3％Na Cl、0.1％胰蛋白酶、0.6％胆盐，调整至pH为8.0)中，于37℃培养，分别在0、3、5、7、8h时吸取菌液稀释涂布，用平板计数法计算活菌数，测定菌株在肠中的耐受性。

[0058]以新鲜MRS培养基为空白对照，计算存活率。(参见图5)食物经过胃部消化后进入肠道，肠道中的菌群生长会受到多种成分的影响，益生菌需要有能力耐受肠道内的胰蛋白酶及碱性环境才能够发挥其益生作用。[0059]由图5可知，副干酪乳杆菌PLBS001在模拟人工肠液中处理8h后存活率能够维持到40％以上，说明副干酪乳杆菌PLBS001具有很好的人工肠液耐受能力。[0060]由于副干酪乳杆菌具有较强的耐酸性、耐胆盐和耐人工胃肠液的性能，能阻止致病菌在肠道的生长和繁殖，因此，本发明将副干酪乳杆菌PLBS001应用于宠物犬犬粮中，为了验证本发明的副干酪乳杆菌PLBS001在宠物犬犬粮中的应用价值，本发明还提供一株副干酪乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用方法。[0061]一、试验动物及饲养管理[0062]选取体重相近、健康状况良好的1岁左右贵宾成犬，按体重相近原则，随机分为4个处理组(对照组和三个试验组)。预饲14天后，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮基础上添加副干酪乳杆菌PLBS001。试验期为28天。[0063]饲养试验在洁净良好的动物房中完成，试验期保持通风良好，维持室温在25～32℃；每只试验犬单独饲养，并于每天下午在室内空地自由活动，试验期间正常驱虫和清洁。[00]基础日粮参照NRC(2012)营养需要，按照宠物犬养殖场的配方配制。[0065]二、饲料配方

[0066]在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，添加量为200～1500mg/kg。[0067]三、测定指标[0068]被毛质量

[0069]于试验开始和结束时分别测定各宠物犬的被毛手感力度、柔顺度和光亮度。

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(a)手感力度：手感被毛对手部的力量，力量越大分数越高，以十分制计。

[0071](b)柔顺度：触摸犬只被毛，顺应毛发方向，感受柔顺度，柔顺度越高分数越大，以十分制计。[0072](c)光亮度：自然光源下，同一位置，目测光亮程度，程度越大，分数越高，以十分制计。

[0073]生长性能

[0074]在正式试验开始的第0、28天的16：00空腹称重，准确记录每个试验组中宠物犬的重量，计算平均日增重；准确记录每条宠物犬每天的采食量，计算平均日采食量；通过日增重和日采食量计算料重比。

[0075]早晚各一次观察宠物犬的状况，对各组腹泻程度、死亡率进行判定。

[0076]为了进一步验证本发明的副干酪乳杆菌PLBS001在宠物犬犬粮中的应用价值，本发明以上述应用方法饲养宠物犬，设置如下若干实施例，并对各实施例中宠物犬的相关指标进行测定。各实施例中宠物犬的饲养管理方法相同，仅改变实施例中副干酪乳杆菌PLBS001的添加量，因此，各实施例中相同的内容不再列出。[0077]各实施例中副干酪乳杆菌PLBS001的添加量见表一；各实施例中宠物犬的相关指标结果见表二、表三。[0078]对比例

[0079]在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，添加量为0。[0080]养殖完成后，测得宠物犬的被毛手感力度评分为5.37，柔顺度评分为8.25，光亮度评分为6.02；宠物犬的平均日增重为16g、平均日采食量为129.4g、料重比为8.09，腹泻率为3.1％，死亡率为3.1％。[0081]实施例1

[0082]在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，添加量为720mg/kg。[0083]养殖完成后，测得宠物犬的被毛手感力度评分为6.13，柔顺度评分为9.10，光亮度评分为6.61；宠物犬的平均日增重为21.6g、平均日采食量为135.4g、料重比为6.27，腹泻率为0.6％，死亡率为0.5％。[0084]实施例2

[0085]在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，添加量为943mg/kg。[0086]养殖完成后，测得宠物犬的被毛手感力度评分为6.08，柔顺度评分为9.04，光亮度评分为6.59；宠物犬的平均日增重为20.9g、平均日采食量为132.7g、料重比为6.35，腹泻率为0.6％，死亡率为0.2％。[0087]实施例3

[0088]在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，添加量为1120mg/kg。

[00]养殖完成后，测得宠物犬的被毛手感力度评分为6.10，柔顺度评分为9.08，光亮度评分为6.58；宠物犬的平均日增重为21.3g、平均日采食量为134.6g、料重比为6.32，腹泻率为0.7％，死亡率为0.4％。

[0090]由于各实施例的实施过程均相同，因此，其他实施例的具体过程不再列出，仅列出上述三个效果较好的实施例。

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表一 各实施例中副干酪乳杆菌PLBS001的添加量mg/kg

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表二 宠物犬的被毛质量

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表三 宠物犬的生长性能

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由上述实施例可以看出，在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌

PLBS001，能够提高宠物犬的被毛手感力度、柔顺度和光亮度，毛发美观性和观赏性都比较高。由于被毛的生长发育与机体对氨基酸、维生素以及钙、磷铜、铁、锌、硒等矿物质元素的吸收有关，当机体对氨基酸、维生素以及矿物质元素的吸收较充分时，被毛的质量较好；因此，在宠物犬的基础日粮中添加副干酪乳杆菌PLBS001，能够促进宠物机体对氨基酸、维生素以及矿物质元素的吸收，滋养皮肤，显著改善宠物的被毛品质。[0098]由上述实施例可以看出，在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，能够提高宠物犬的平均日增重和平均日采食量，降低宠物犬的料重比，说明副干酪乳杆菌PLBS001增强了宠物犬的肠道消化酶活性，提高了宠物犬对营养物质的利用率。副干酪乳杆菌PLBS001用作饲料添加剂加入到宠物饲粮中，可以调节肠道菌群、增强胃肠道的消化吸收功能，保持益生菌优势地位，促进肠胃消化吸收，进而提升动物的生长性能和饲料转化率。

[0099]在宠物犬的基础日粮中添加本发明的副干酪乳杆菌PLBS001，能够降低宠物犬的腹泻率和死亡率，说明副干酪乳杆菌PLBS001增强了宠物犬的免疫功能。副干酪乳杆菌PLBS001通过与肠黏膜结合形成生物屏障、促进细胞免疫和体液免疫，维持肠道微生态平衡和正常生理功能，提高机体的免疫功能，减少疾病的发生，降低宠物的死亡率。[0100]另外，通过上述实施例可以看出，在宠物犬的基础日粮中添加本的副干酪乳杆菌PLBS001的添加量为720～1120mg/kg时，宠物犬的被毛质量和生产性能最好，腹泻率和死亡率最低，因此，在宠物犬的基础日粮中，副干酪乳杆菌PLBS001的最适添加量为720～1120mg/kg。

[0101]综上所述，本发明提供的副干酪乳杆菌PLBS001，具有较强的耐酸性、耐胆盐和耐人工胃肠液的性能，在宠物犬日粮中添加适宜水平的副干酪乳杆菌PLBS001，能够提高宠物犬的被毛手感力度、柔顺度和光亮度，毛发美观性和观赏性都比较高；同时能够提高宠物犬对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高宠物犬的生产性能和机体免疫力，降低宠物犬的腹泻率和死亡率，有助于增加宠物犬养殖的经济效益。[0102]当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

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图3

图4

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图5

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