生物医学工程研究 ２０１６ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ －ｕ… ：３Ｏ３～３０８ 一 Ｊ３５｛４｝．新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究 苗宗宁△，吴卫江，钱寒光，赵基栋 （江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡２１４０４１） 摘要：研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法，为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来 源。取新生ｓＤ大鼠的海马区脑组织，采用ａｃｃｕｔａｓｅ结合机械分离法获取神经干细胞，在含有Ｂ一２７、碱性成 纤维生长因子和表皮生长因子的ＤＭＥＭ／Ｆ１２无血清培养液中培养；Ａｃｃｕｔａｓｅ酶消化后传代培养，取第３代 细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含１０％胎牛血清培养液诱导分化，神经元特异烯醇化酶和胶质纤维 酸性蛋白免疫荧光染色检测ＮＳＣｓ向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细 胞，在无血清培养液中形成大量的神经球，部分神经球出现融合及贴壁分化现象，细胞呈典型ＮＳＣｓ形态。 经巢蛋白染色鉴定，大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后，可分化为神经元特异烯 醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的ＮＳＣｓ具有自我更新和增殖 能力，在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。 关键词：海马；神经干细胞；分离培养；细胞分化；新生大鼠 中图分类号：Ｒ３１８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２－６２７８（２０１６）０４－０３０３－０６ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｒａｔｓ ＭＩＡＯ Ｚｏｎｇｎｉｎｇ，ＷＵ Ｗｅｉｊｉａｎｇ，ＱＩＡＮ Ｈａｎｇｕａｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉｄｏｎｇ （Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｐｉｔａｌ ｏｆＷｕｘｉ，Ｗｕｘｉ ２１４０４１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｕｈｕｒｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅＨｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｅａｍｐｕｓ ｏｆ ｎｅｏｎａｔＭ ｒａｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆｉｎｄ ａ ｓｕｉｔ— ａｂｌｅ ｃｅ１ｌ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＮＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｕｓｅ ａｃｃｕｔａｓｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ａｒｅａ ｏｆ ｎｅｏｎａｔ￣ＳＤ ｒａｔ．Ｔｈｅ ｃｅＨｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｓｅｒ‘ ａｍ—ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ，Ｂ２７，ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ａｎｔｉ ｎｅｓｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ａｃｃｕｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｈｕｒｅ．Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＮＳＣｓ．ＮＦ一２００ ａｎｄ ＧＦＡＰ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＳＣｓ ｔｏ ｎｅｕ— 、 ｔｏｎｓ ｎｄ ｒａ￣ｉｌａ ｃｅｌ１．Ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｏｆ ｎｅｏｎａｔｌａ ｒａｔｓ，ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｏｍｅｒｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｔｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｐｈｅｒｅｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ｆｕｓｅｄ ａｎｄ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｙｐｉｃａｌ ＮＳＣｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｏｓｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅｓ ｃｏｕｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉｌ ｆａｉｂｅｒｓ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔｉｎｉａｎｇ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅ ＮＳＣｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒｏｍ ｔｆｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔｓ ｈａｓ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｆ—ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉｌ ｔａｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉｌ ｃｅｌｌａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｔｉｎｉａｎｇ ｆｅｔｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ．ａ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ；Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｎｅｏｎａｔｌ ｒａｔｓ ａＤＯＩ １０．１９５２９／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７２—６２７８．２０１６．０４．１８ △通信作者Ｅｍａｉｌ：ｚｏｎｇｎｉｎｇｍ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｅｏｍ ３０４ 生物医学工程研究 第３５卷 １ 引 言 神经干细胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）是一类起 源于神经外胚层，具有自我更新能力并在一定条件 下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞¨ Ｊ。 胚胎期和成人中枢神经系统均发现有神经干细胞， 其存在于特殊的ｎｉｃｈｅｓ中，通过自分泌或旁分泌的 方式可以产生多种神经细胞因子，神经递质等特异 性的功能蛋白 Ｊ。研究表明移植ＮＳＣｓ可有效地 修复损伤的脊髓组织，重建神经间的连接，治疗脊髓 损伤（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ，ＳＣＩ） －９ Ｊ。ＮＳＣｓ主要存在 于哺乳动物侧脑室的室管膜下区和海马的齿状回颗 粒下层以及脊髓管室管膜区等 。本实验采 用无血清培养法进行新生大鼠海马ＮＳＣｓ体外分离 培养，观察其在体外增殖、分化等一系列细胞形态学 变化，为细胞移植治疗ＳＣＩ提供有效的细胞来源。 ２材料与方法 ２．１实验动物 新生ＳＤ大鼠，由江苏省血吸虫病防治研究所 提供，许可证号ＳＣＸＫ（苏）２００７—００２１。 实验试剂及材料：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，胎牛血 清，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ—Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂ— ＣＯ）；Ｂ一２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；表皮生长因子，碱性成纤维 细胞生长因子（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）；兔抗大鼠ｎｅｓｔｉｎ单克隆 抗体，兔抗大鼠ＧＦＡＰ单克隆抗体，兔抗大鼠ＮＳＥ 多克隆抗体，ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔Ｉｇ Ｇ（ａｂｃａｍ）； ＤＡＰＩ，多聚赖氨酸（Ｓｉｇｍａ）；ＩＸ一７１荧光显微镜（Ｏ— ｌｙｍｐｕｓ）；ＣＫＸ４１倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）；培养瓶，离 心管，移液管（Ｃｏｍｉｎｇ）；ｓＡＢＣ试剂盒（ＢＯＳＴＥＲ）； ＣＯ：细胞培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ）。 ２．２方法 ２．２．１新生大鼠海马神经干细胞分离培养及鉴定 取新生ＳＤ大鼠（出生２４ ｈ以内），颈椎脱臼法处 死，碘酒浸泡１ ｍｉｎ后７５％乙醇漂洗３次×２ ｒａｉｎ／ 次。剪开头皮及颅骨，在解剖显微镜下，分离出海马 区脑组织。用显微镊剥除脑膜及血块并用预冷的Ｄ —Ｈａｎｋ’Ｓ液漂洗２次，用眼科剪剪碎，Ａｃｃｕｔａｓｅ蛋 白酶３７￣Ｃ消化３ ｍｉｎ，用弯头滴管轻柔吹打，制成单 细胞悬液，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，弃去上清液收集 沉淀细胞，加入３ ｍｌ完全培养基（ＤＭＥＭ／Ｆ一１２＋ ２％Ｂ一２７＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ—Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ＋２０ ｒｉｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋２０ ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ），混匀后接种于ｌ２．５ ｃｍ 培 养瓶，３７℃、５％ＣＯ 、饱和湿度条件下静置培养，第 三天开始每３天更换培养液１次，２周左右传代１ 次。 换液时将培养瓶中培养液轻轻混匀后移至离心 管，８００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，吸出一半上清液，加入一 半３７。【＝预温的完全培养基，混匀后接种至培养瓶。 传代时将培养瓶中培养液轻轻混匀后移至离心 管，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，吸出上清液，加入Ａｃ— ｃｕｔａｓｅ蛋白酶３７℃消化３ ｍｉｎ，加入５ ｍｌ完全培养 基，用弯头滴管轻柔吹打，８００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，弃 去上清液收集沉淀细胞，加入完全培养基，按照１：３ 的比例传代培养。 鉴定时无菌条件下取多聚赖氨酸包被的盖玻 片，置于６孔板内，收集第三代ＮＳＣｓ，接种到盖玻片 上，培养３天后，取出盖玻片，Ｄ—Ｈａｎｋ’Ｓ液漂洗２ 次，４％多聚甲醛固定３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗３次后山羊 血清封闭２０ ｒａｉｎ，弃血清加入兔抗大鼠ｎｅｓｔｉｎ单克 隆抗体（１：１０００），３７℃孵育２ ｈ，ＰＢＳ漂洗３次后加 入ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔Ｉｇ Ｇ（１：１ ０００），３７ｏＣ避光 反应３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗后荧光显微镜下观察。 ２．２．２新生大鼠海马神经干细胞诱导分化及鉴定 无菌条件下取多聚赖氨酸包被的盖玻片，置于６ 孔板内，收集第三代ＮＳＣｓ，应用诱导培养基 ｆ ＤＭＥＭ／Ｆ一１２＋１０％ＦＢＳ＋２％Ｂ一２７＋１％Ｐｅｎｉ— ｃｉｌｌｉｎ—Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ＋２０ ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋２０ ｎｇ／ｍｌ ｂＦ— ＧＶ）接种到盖玻片上，每天在倒置显微镜下观察细 胞形态。培养７天后，取出盖玻片，Ｄ—Ｈａｎｋ’Ｓ液漂 洗２次，４％多聚甲醛固定３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗３次后 山羊血清封闭２０ ｒａｉｎ，弃血清，分别加入兔抗大鼠 ＧＦＡＰ单克隆抗体（１：５００）和兔抗大鼠ＮＳＥ多克隆 抗体（１：５００），３７ｏＣ孵育２ ｈ，ＰＢＳ漂洗３次后加入 ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔Ｉｇ Ｇ（１：１ ０００），３７￣Ｃ避光反 应３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗后加入终浓度为１００ ｒｉｇ／ｍｌ ＤＡ— ＰＩ溶液避光状态下行细胞核染色５ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗后 荧光显微镜下观察。 ３ 结果 ３．１ 新生大鼠海马神经干细胞分离培养及鉴定 从海马组织分离的细胞原代接种后，在显微镜 下观察可见细小组织团块以及单个细胞，细胞悬浮 生长，多呈圆形，大小不一，折光性强。接种２～３天 后，可见细胞碎片增多，部分细胞贴壁，随着时间的 推移，悬浮细胞集聚成小细胞团，逐渐长成由细胞组 成的桑葚状细胞球，部分细胞球因体积过大出现细 胞球中心颜色暗淡、透光性较差。体外传代培养后， 死亡细胞以及组织碎片减少，可见典型神经球形成， 免疫荧光染色结果显示神经球中有大量ｎｅｓｔｉｎ阳性 细胞存在，见图１。 第４期 苗宗宁。等：新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究 ３０５ ＾ 、 Ｂ ’ （ １＾ ’ ● Ｄ ｌ 霪 謦， ● － ，Ｌ● －，图１ 新生大鼠海马神经干细胞分离培养及鉴定。 Ａ．原代培养３天×４０；Ｂ．原代培养１０犬ｘ １００；Ｃ．传代培养７火ｘ ２ＯＨ０；Ｄ．Ｅ ＮＳＣｓ免疫荧光染色 爪ｎｅｓｔｉｎ 性细胞×１００一 Ｆｉｇ Ｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗｂｏｒｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，． Ａ． Ｆｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（＇ｆ ｐｒｉｍｍ３ ｇｅｎｅｒａｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｔ ３ ｄｎｙｓ ｘｄＯ；Ｈ．Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈ￣ｏｌｏｇ３ｔｌｒＩ ．ｎａｒｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｃｎ 【ｓ ａｔ １０ ｄａｙｓ ｘ １００； Ｃ．Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｔ）ｒ ｓｕ１）（，ｕｌｍｒｅ，．ｅｌｌｓ ａｔ ７ ｄａｙｓ×２００：Ｉ）一Ｅ．ＮＳＣｓ ｉｍｍｕｎｏｔ］ｕｏｒｅｓｃｅｌｉｔｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｒｏｗ ｎｅｓｔｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ×１００． ３．２新生大鼠海马神经干细胞诱导分化及鉴定 『日】的延长，边缘部位细胞突起逐渐变长、增多，与相 用含血清培养基培养ＮＳＣｓ后，显微镜下可见 ＮＳＣｓ球很快贴壁，２４ ｈ后大量贴壁生长细胞从 ＮＳＣｓ球周围长出。开始阶段由于细胞密度大，以 ＮＳＣｓ球为中心向四周放射状成片牛长，随着培养时 邻的细胞构成网状结构，细胞中既有具有多个长突 起的神经胶质样细胞，也有具有短突起的神经元样 细胞，见图２。免疫荧光染色结果可见大量ＧＦＡＰ ｌ，＇ｌ－．ｔｍ胞及ＮＳＥ阳性细胞，见图３。 ｌ｛ 、 ‘ ，毒 ● 、（ 【］ 二、 ． ） Ｌ ’ ‘ ＇ ＾ － 图２ ＮＳＣｓ诱导分化后细胞形态变化 Ａ．分化３人ｘ４０：Ｂ．分化７人ｘ４０；Ｃ．分化ｌ０夫×１００：Ｄ．分化１４人×１００ Ｆｉｇ ２＂ｌｉｅ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｑｏｔｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ａｆｔｅｒ ＮＳＣｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｔ ｄａｙ ３．７，１０ ａｎｄ １４ 生物医学工程研究 第３５卷 ≥’ ： ’麓ｖ ： ， 麓 ： ． 譬 ０ ’ ｜． ． ； ，‘ 、 、 。－ ０， ｊ ｜ ．＿ 。 ≮．． － ． 一． ．． ．０ ｌＩ ．’ ｌ一 。 ‘ ・ ｔ ， 。 ‘ 一 ｆ＿１ ＿ ｊ ， ． ＾ ＾ ０： ≤ ＿－ 书 一 ０ Ｙ 一 】～一 ， ＿ｌＪ ，； ｔ， ● 羹 ．赫 ：～： 羹 用¨卜 ． ，图３ ＮＳＣｓ诱导分化后免疫荧光染色ＧＦＡＰ和ＮＳＥ表达。Ｂａｒ＝１ＯＯｌｕｎ Ｔｉｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＳＥ ａｎｄ ＧＦＡＰ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ＮＳＣｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂａｒ＝ＩＯＯｐｍ ４讨论 神经于细胞是一类原始的未分化的多潜能干细 胞，具有自我更新能力，主要向神经系统方向分化， 因此，获取大量ＮＳＣｓ并建立稳定的分离 培养方法尤为重要。本实验从新生大鼠海马组织分 离并培养了ＮＳＣｓ，体外可以增殖，通过条件培养基 可以诱导分化为神经元和神经胶质细胞，为进一步 研究ＮＳＣｓ体内移植后的分化和ＮＳＣｓ治疗ＳＣＩ提 供了前期的技术支持，， 如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等，存在于 海马齿状同和室管膜下区等区域川。。 ，在ＳＣＩ治疗 的相关研究中，ＮＳＣｓ移植受到广泛关注，此类方法 多是通过促进移植到ＳＣＩ：部位的外源性ＮＳＣｓ有效 研究表明不同部位来源的中脑神经干细胞具有 的，Ｌ－．物学特性，即具有“区域特异性” 。本实 地向神经元分化，促进脊髓重建及神经修复的作 验对新，Ｉ 、鼠海马神经Ｆ细胞进行了分离培养，由 第４期 苗宗宁。等：新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究 于新生小鼠海马组织体积非常小，因此，建立适合的 分离培养方法就很重要。神经干细胞原代分离主要 采用酶消化法和机械吹打法，研究表明酶消化过程 和机械打散都对细胞的活性造成不利影响，常见的 胰蛋白酶通过水解细胞间的蛋白质使细胞分离，但 其消化能力较强，容易造成细胞膜上的蛋白质也被 消化，进而释放其核内的ＤＮＡ，而这些ＤＮＡ具有很 强的黏性，会将分离消化的单细胞黏附在一起，从而 引起细胞的损伤和死亡。机械吹打可以避免细胞膜 被消化，但不易掌握吹打的次数和力度，可造成细胞 膜的机械损伤，导致细胞活性下降及死亡 。这说 明需要改进消化过程，例如换用消化能力更加温和 的酶，并且减少吸管吹打。研究发现ａｃｃｕｔａｓｅ消化 酶通过化学解离的方法来分散组织，在细胞培养中 的损伤作用具有非特异性＿】 。本实验中采用ａｃ— ｃｕｔａｓｅ来分散海马组织和神经球进行原代和传代分 离培养，并辅以轻微的机械吹打，尽可能减少对细胞 的损伤。由于海马组织体积很小，分离后不通过滤 网过滤而直接培养，死亡细胞以及组织碎片通过更 换培养液以及液化作用可以缓慢去除，这样可以尽 可能保留存活细胞。 目前主要通过悬浮培养法体外培养ＮＳＣｓ，这是 保持ＮＳＣｓ干性的重要条件 卜１８１。ＥＧＦ主要是维 持干细胞的长期存活生长，可以促进ＮＳＣｓ进行对 称性，产生的子代细胞均可继续。Ｂ一２７、 ｂＦＧＦ则起到维持细胞悬浮、抑制神经干细胞分化的 作用，ｂＦＧＦ还可促进ＮＳＣｓ进行非对称性，所 产生的子代细胞中只有一个细胞能够继续。 ｂＦＧＦ与ＥＧＦ同时应用，ｂＦＧＦ可以显著加强ＥＧＦ 的作用Ｈ 射 。本实验以ＤＭＥＭ／Ｆ１２为基础培养 基，辅以Ｂ２７添加剂，同时加入ｂＦＧＦ及ＥＧＦ构成 完全培养基，成功培养出ＮＳＣｓ，并进行了有效地增 殖和分化。 Ｎｅｓｔｉｎ是一种中间丝蛋白成分，属于第Ⅵ类中 间丝蛋白，仅在胚胎早期神经上皮表达，当神经前体 细胞向终末方向分化为神经元和胶质细胞时，Ｎｅｓｔｉｎ 便停止表达，故最常用来鉴定ＮＳＣｓ 。ＮＳＥ和 ＧＦＡＰ均为一种胞浆蛋白，ＮＳＥ主要表达于神经元。 ＧＦＡＰ属Ⅲ型中间丝蛋白家族成员，在活化的星型 胶质细胞中大量特异性表达 。实验中培养的神 经球经免疫荧光染色可见大量Ｎｅｓｔｉｎ阳性细胞存 在，表明成功培养出未分化的ＮＳＣｓ。神经球用体积 分数为１０％胎牛血清的培养基培养后，可见神经球 贴壁后向四周延伸出多个突起，逐步形成相互连接， 交错成网，ＮＳＥ和ＧＦＡＰ染色显示阳性，说明神经干 细胞在一定条件下可以分化为神经元和星形胶质细 胞。实验选取新生大鼠海马组织进行体外分离培 养，尽管优化了取材方法，仍无法避免杂细胞，因此 取材与培养方法需要进一步改进，从而快速、精确的 获取ＮＳＣｓ。 参考文献： ［１］Ｒｈｉｍ ＪＨ，Ｌｕｏ Ｘ，Ｘｕ Ｘ ｅｔ ａ１．Ａ Ｈｉ ｇｈ—ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｓ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｄｂｒｍｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｅｃｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｉｌｓ［Ｊ］． Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１５，５：１６２３７． ［２］马浚宁，高俊玮，侯博儒，等．新生小鼠海马、嗅球及皮质神经 干细胞的分离培养及鉴定［Ｊ］．中国组织工程研究，２０１４，１８： ７２６６—７２７２． ［３］孟磊，周文科，金保哲，等．成年ｓＤ大鼠海马齿状神经回神经 干细胞分离培养和鉴定的改良［Ｊ］．中国实用神经疾病杂志， ２０１４，１７：１—５． ［４］Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ Ｌ，Ｃｏｖａｃｕ Ｒ，Ｅｓｔｒａｄａ ＣＰ ｅｔ ａ１．Ｌｏｎｇ—ｄｉｓｔａｎｃｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｈ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏ— ｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｍｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５，２８８：４７—５５． ［５］Ｒａｍｏｓ—Ｍａｎｄｕｊａｎｏ Ｇ，Ｈｅｒｎｄｎｄｅｚ—Ｂｅｎｔｔｅｚ Ｒ，Ｐａｓａｎｔｅｓ—Ｍｏｒａｌｅｓ Ｈ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ｔａｕｒｉｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ａ－ ｄｕｈ ｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１４，１２（３）：６９０—７０２． ［６］Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍ，Ｏｋａｎｏ Ｈ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｎｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１３， ２３（１）：７０—８０． ［７］Ｔｓｕｊｉ Ｏ，Ｍｉｕｒａ Ｋ，Ｆｕｊｉｙｏｓｈｉ Ｋ ｅｔ ａ１．Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎ— ｊｕｒｙ ｂｙ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉＰＳ／ＥＳ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１ １，８（４）：６６８—７６． ［８］Ｔｅｔｚｌａｆｆ Ｗ，Ｏｋｏｎ ＥＢ，Ｋａｒｉｍｉ—Ａｂｄｏｌｒｅｚａｅｅ Ｓ ｅｔ ａ１．Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅ－ ｖｉｅｗ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒｎａｍａ，２０１１，２８（８）：１６１１—８２． ［９］Ｍｏｔｈｅ ＡＪ，Ｔａｔｏｒ ＣＨ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｌａ ｓｔｅｍ／ｐｒｏ－ ｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｉｌｓ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１３，３１ （７）：７０１—１３． ［１Ｏ］Ｂａｕｅｒ Ｒ，Ｋａｉｓｅｒ Ｍ，Ｓｔｏｌｌ Ｅ．Ａ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｌａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｇｌｉｏｍａ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｌｉ－ ｆｅｓｐａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（１１）： ｅ１１１２１９． ［１１］ＳｕｎＴ，ＷａｎｇＸＪ，Ｘｉｅ ＳＳ ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｃａｐａｃ－ ｉｔｙ ａｎｄ ｐａｓｓａｇｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｈｅｒｅｎｔ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１ １， ２９（７）：７２３—７３１． ［１２］Ｍｉｒａｓ—Ｐｏｒｔｕｇａｌ ＭＴ，Ｇｏｍｅｚ—Ｖｉｌｌａｆｕｅｒｔｅｓ Ｒ，Ｇｕａｌｉｘ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｎｕ— ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒ－ ｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１６，１０４：２４３—２５４． ［１３］Ｑｉａｎ ｘ，Ｄａｖｉｓ ＡＡ，Ｇｏｄｅｒｉｅ ＳＫ ｅｔ ａ１．ＦＧＦ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａ ｆｒｏｍ ｍｕｈｉｐｏｔｅｎｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｎ，１９９７，１８（１）：８１—９３． ３０８ 生物医学工程研究 第３５卷 ［１４ ＪＬｅｅ Ｈ，ｒｕｎ Ｓ，Ｋｉｍ ＩＳ ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｂｒａｉｎ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｇｒａｆｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｒｅｓｔｒａｉｎ —ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＥＧＦ ａｎｄ ｂＦＧＦ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１４，２２９（４）：４７９—８８． ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｅｍｐｏｒｌ ｌａｏｂｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１４，９（８）：ｅ１０４０９２． ［２０］Ｓａｋａｙｏｆｉ Ｎ，Ｋｉｍｕｒａ Ｒ，Ｏｓｕｍｉ Ｎ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｎ ｎｅｕ— ｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ，２０１３，２０１３：９７３５０８． ［１５］张蕾，李晓莉．神经于细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养 ［Ｊ］．中国现代医学杂志，２０１２，２２（２０）：５２—５． ［１６］徐富翠，邹礼乐，梅欣明．神经干细胞培养及其影响因素［Ｊ］． 中国组织工程研究，２０１３，１０：１８３５—１８４０． ［１７］Ｚａｎｎｉ Ｇ，Ｄｉ Ｍａｒｔｉｎｏ Ｅ，Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ Ａ ｅｔ ａ１．Ｌｉｔｈｉｕｍ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ ｎｅｕｒｌ ｓｔａｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅｓ ［２１］Ｃｈｏ Ｔ，Ｒｙｕ ＪＫ，Ｔａｇｈｉｂｉｇ／ｏａ Ｃ ｅｔ ａ１．Ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏ． ｍｏｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ／ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（１０）：ｅ７６８６０． ［２２］Ｔｏｍｉｔａ Ｔ，Ａｋｉｍｏｔｏ Ｊ，Ｈａｒａｏｋａ Ｊ ｅｔ ａ１．ｃｌｉｎｉｃＵｐａｔｈ０ｌ０ｇｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｉｆ－ ｃａｎｃｅ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ，ａ ｎｅｕｒｌ ｓａｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ， ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌ，２０１４，３１（３）：１６２ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１５， ６（３５）：３７０８３—９７． ７１． ［２３］Ｈａｃｈｅｍ ＬＤ，Ｍｏｔｈｅ ＡＪ，Ｔａｔｏｒ ＣＨ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＢＤＮＦ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｐｃ－ ｔｅｎｔｉａ１ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ０ｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ Ａ— ［１８］Ｇｉａｃｈｉｎｏ Ｃ，Ｂａｓａｋ Ｏ，Ｌｕｇｅｒｔ Ｓ ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｕｂｄｉ— ｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２０１４，３２（１）：７０—８４． ｄｕｈ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ—Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ／Ｐｍｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ，２０１５，４（１）：１４６—５９． ［１９］Ｆｏｒｔｉｎｏ ＶＲ，Ｃｈｅｎ ＲＳ，Ｐｅｌａｅｚ Ｄ ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ （收稿日期：２０１６—０４—０７） （上接第３０２页） ［７］Ｎｉ【ｇｇｌｉ Ｈ．Ｕｌｔｒａｗｅａｋ ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｓ ｂｉｏｐｈｏ— ｔｏｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｌｉｆｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｊ ｊ．Ｊ Ｅｌｅｃｔｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｙｓｔ， ２０１４，３：２３３２—０７９６． ［１ ２］Ｐｏｐｐ Ｆ Ａ，Ｌｉ Ｋ Ｈ．Ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｓｕｆｉｃｉｆｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌｙ ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｅｒｇｏｄｉｃ ｆｉｅｌｄ［Ｊｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，１９９３，３２（９）：１５７３—１５８３． ［８］Ｐｏｐｐ Ｆ Ａ，Ｙａｎ Ｙ．Ｄｅｌａｙｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｎｌｓ ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｓｔａｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｃｓ ＬｅｔｔｅｒｓＡ，２００２，２９３（１）：９３— ９７． ［１３］Ｇｕｏ Ｚ，Ｚｈｕ Ｙ，Ｍａ Ｊ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ ｕｌｔｒａ— ｗｅａｋ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｈｉｏｐｈｏｔｏｎ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｆ Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈｏｔｏｎｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２０００，２９（１０）：８９０—８９３． ［１４］Ｈａｕ Ｊ，ｒａｎｇ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｑｕａｎｔｕｍ：ｍａｙ ｂｅ ａ ｎｅｗ—ｆ０ｕｎｄ ｍｅｓ－ ｓｅｎｇｅｒ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ－［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒｅｎｄｓ，２０１ １，５（３）： ８９—９２． ［９］ｂｅｌｏｕｓｓｏｖ Ｌ Ｖ，Ｐｏｐｐ Ｆ Ａ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ［Ｍ］．Ｍｏｓｃｏｗ：Ｂｉｏｉｎｆｏｎｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９５．２５７—２６５． ［１０］Ｃｈａｎｇ Ｊ Ｊ，Ｆｉｓｃｈ Ｊ，Ｐｏｐｐ ＦＡ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ［Ｍ］．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：Ｋｌｕｗｅｒ， １９９８．２１７—２２７． ［１５］韩金祥．中药药性的科学内涵［Ｊ］．中华中医药学刊，２０１１，２９ （０９）：１９３７—１９３９． ［１ １］Ｐｏｐｐ Ｆ Ａ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈｏｔｏｕｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａ— ｔｉｏｎｓ．［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，４１（５）： ３９】一４０２． （收稿日期：２０１６—０８—１６）
