第１７卷第１５期中国实验方剂学杂志Ｖｏｌ－１７．Ｎｏ．１５２０１１年８月Ｃｈｉｎｅ８ｅＪｏｕｍａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃａｌＦｏ瑚ｕｌａｅＡｕｇ．，２０ｌｌＨＰＬＣ同时测定葛根芩连汤中１２个有效成分的含量章军１，刘宇政１”，王跃生１，刘安ｈ（１．中国中医科学院中药研究所，北京１００７００；２．江西中医学院，南昌３３０００６）【摘要】目的：建立同时测定葛根芩连汤中葛根紊、大豆苷、甘草苷、黄连碱、药根碱、黄芩苷、小檗碱、巴马汀、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸铵１２个有效成分含量的ＨＰＬＣ－ＤＡＤ测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱ＭｅｒｃｋＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ，ＲＰ－１８ｅ（４．６ｍｍ×１００ｍｍ），流动相为乙腈旬．０５％磷酸（含Ｏ．Ｏｌｍｏ卜Ｌ“磷酸二氢钾）梯度洗脱；流速２ｍＬ・ｍｉｎ～，柱温３５℃，检测波长２５０，２７５，３４５ｎｍ。结果：１２个成分的方法学考察均合格，阴性无干扰。结论：本方法简便、快速、准确可靠，专属性强，可用于葛根芩连汤的质量控制。【关键词】葛根芩连汤；同时测定；黄酮类；生物碱类；皂苷类；高效液相色谱法［中图分类号】Ｒ２８４．１【文献标识码］Ａ［文章编号】１００５－９９０３（２０１１）１５ＪＤ０５８旬５ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ１２ＡｃｔｉＶｅＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓＩｎＧｅｇｅｎｑｉｎｌｉａｎＤｅｃｏｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣＺ删ⅣＧ几ｎ１，￡，Ｕｈ一施ｅ增１”，张ⅣＣ地ｅ．ｓ＾ｅ昭１，ＵＵＡｎｌ＋（１．胁砌ｕ抛矿铂ｉ麟ｅ肘口ｆｅ砌肘ｅｄ记ｏ，Ｃ＾ｉ嬲Ａｃ口ｄｅｍ，’矿ｃ＾ｉ厅ｅｓｅ膨ｅｄ记口ｚ５ｃ诒，啪，曰ｅ驴增１００７００，ＣＪＩｌｉｎ口；２．．，施，郴ｉＣ，ｎｉｔ肥，．ｓｆ钞旷７ｈｄｆｆ幻ｎ口ｚｃ＾打Ｉ鳓ｅ＾如ｄ如ｉ，ｌｅ，舭，ＩｃＪＩｌ口，ｌｇ３３０００６，Ｃ＾ｉ乃口）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ｏｂｊｅｃｔｉＶｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａＨＰＬＣ・ＤＡＤｍｅｔｈｏｄｆｂＴｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｕｅｒａｒｉｎ，［收稿日期］２０１１Ⅲ３．１７【基金项目】国家“９７３计划”项目（２０１０ＣＢ５３０６０２）【第一作者】章军，实习研究员，从事分析化学，Ｔｅｌ：ｏｌＯ一６４０１４４１１．２８４８，Ｅ—ｍａｎ：ｊｕｎｚｈ¨９６５４３２ｌ＠ｙａｈ∞．ｃ∞．ｃ“【通讯作者】’刘安，副研究员，硕士生导师，从事中药化学，Ｔｅｌ：ＯｌＯ缶４０ｌ“ｌｌ－２９３８，Ｆ“：ＯｌＯ斟０１３９９６，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈ１６２＠１６３．ｃｏ“材的质量影响较大。Ｈ１Ｊ林丽聪，吴春敏，陈海滨，等．ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定石仙桃由于野生天麻资源的不断减少，本实验中仅收中天麻素和天麻苷元［Ｊ］．中草药，２００８，３９（２）：２８３．集了３个产地的野生天麻，根据野生天麻中天麻苷、∞１Ｊ李德勋，陈桂，李辅碧，等．天麻不同变异类型药材中天天麻苷元的含量来分析，野生天麻样品中的含量相麻素含量比较［Ｊ］．现代中药研究与实践，２００７，２１对于同一产地的天麻来说，含量较低；而人工种植的（３）：２３．天麻中有效成分的含量普遍较高，本实验结果为栽№１Ｊ梁纪军，田大丰，王中彦，等．ＨＰＬｃ法测定不同产地天麻中天麻素的含量［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００６，２３培天麻替代野生天麻提供了科学的依据。（１）：２６．［参考文献］口１Ｊ袁胜浩，王东，张香兰，等．天麻中天麻素含量的影响因子研究［Ｊ］．云南植物研究，２００８，３０（１）：１１０．［１］中国药典．一部［Ｓ］．２００５．竺．１Ｊ关萍，高玉琼，石建明，等．不同产地野生及栽培天麻中［２］吴刚，秦民坚，康继川，等．不同产地天麻质量评价天麻素含量比较［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，３０［Ｊ］．现代中药研究与实践，２００７，２ｌ（１）：１３．（２１）：１６９８．［３］国家医药管理局和卫生部．七十六种药材商品规格标［责任编辑蔡仲德］准［Ｓ］．１９８４．・５８・万方数据章军．等：ＨＰＬｃ同时测定葛根芩连汤中１２个有效成分的含量ｄａｉｄｚｉｎ，ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ，ｃｏｐｔｉｓｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｊａｔｒｏｒｒｈｉｚｉｎｅｈｙｄｍｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｂａｉｃａｌｉｎ，ｂｅｒｂｅｒｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏ—ｄｅ，ｐａｌｍａｔｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｗｏｇｏｎｏｓｉｄｅ，ｂａｉｃａｌｅｉｎ，ｗｏｇｏｎｉｎａｎｄａｍｍｏｎｉｕｍｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎａｔｅｉｎＧｅｇｅｎｑｉｎｌｉａｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＡＭｅｒｃｋＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ０．０ｌＲＰ一１８ｅ（４．６ｍｍ×ｌｏｏｍｍ）ｗａ８ｕｓｅｄ；ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａ眈ｗ踮ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ旬．０５％ｍｏｌ・Ｌ一１ｎｍ，ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄ（ｃｏｎｔａｉｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｍａｉｌｌｔａｉｎｅｄｗａ８８ｅｔａｔａｔｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｉｎｒａｔｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａＬｓ２５０，２７５，３４５ｔｈｅｎｏｗｗ船２．０ｍＬ－ｍｉｎ．。ａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ３５℃．Ｒｅｓｕｎ：Ｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，∞ｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｌｉｎｅａｒｉｔｙｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｍｅｔｔｈｅｏｆｔｈｅｔｗｅｌＶｅａｃｔｉＶｅａｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ８．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｗ鹊ｄｅｔｅ皿ｉｎｅｄｃａｎ８ｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ．ＣｏｎｃＩｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉ８ｍｐｉｄ，８ｉｍｐｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅ，ｉｔｈａｓａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＧｅｇｅｎｑｉｎｌｉａｎｇｏｏｄｓｐｅｃｉ６ｃｉｔｙａｎｄｉｔｂｅｓｕｉｔａｂｌｅｌｂｒｔｈｅｄｅｔｅｍｌｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｗｅｌｖｅｄｅｃｏｃｔｉｏｎｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｇｅｇｅｎｑｉｎｌｉａｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；８ｉｍｕｌｔａｎｅｏｕ８ｄｅｔｅ珊ｉｎａｔｉｏｎ；ｎａｖｏｎｅｓ；ａｌｋａＩｏｉｄ８；ｓａｐｏｎｉｎ８；ＨＰＬＣ寰ｌ１２个对照品信息葛根芩连汤出自《伤寒论》，为太阳病误下后形成表邪未解，邪热内陷，出现下利、喘、脉促的太阳阳明合病的表里双解剂…。２０１０年版《中国药典》一部【２１收载的葛根芩连制剂有片剂、丸剂和微丸３种剂型，其含量测定方法为ＨＰＬＣ测定葛根素和小檗碱的含量。为了更好的控制葛根芩连汤的质量，本实验采用ＨＰＬｃ同时测定葛根芩连汤中葛根素、大豆苷、甘草苷、黄连碱、药根碱、黄芩苷、小檗碱、巴马汀、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸铵１２个有效成分的含量，方法简便、快速，运行时间仅４５ｍｉｎ，大大提高了检测效率，并且测世的种类完全，４味药材中的主要有效成分基本涵盖，能全面评价葛根芩连汤的质量。ｌ仪器与试药１．１仪器岛津ＬＣ．２０Ａ高效液相色谱仪，Ｌｃｓｏｌｕｔｉｏｎ工作站；舒美ＫＱ－３２００Ｅ超声清洗器（功率１５０Ｗ）；ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＰ２ｌｌＤ天平。１．２试药对照品均为含量测定用，购买单位及批ｍｏｌ・Ｌ‘１磷酸二氢钾）－Ｂ乙腈，梯度洗脱，０一１５ｍｉｎ，号见表１；乙腈为Ｆｉｓｈｅｒ，ＨＰＬｃ级；水为娃哈哈高纯水；磷酸，含量８５％，分析纯；磷酸二氢钾，分析纯；其余试剂均为优级纯。３批葛根、黄芩、黄连、炙甘草饮片厂家、批号及产地见表２，经本单位何希荣主管药师鉴定，分别为豆科植物野葛ＰＷｒｄｒ谊ｚＤ６０组（Ｗｉｌｄ．）Ｏｈｗｉ的干燥根；唇形科植物黄芩ｓｃｕｔｅ以缸ｒｉ口妇如ａ如邶如Ｇｅｏ晒的干燥根；毛茛科植物黄连Ｃ叩￡ｂｃ＾ｉ，ｌｅｗ蠡Ｆｒａｎｃｈ．的８％一１４％Ｂ；１５—２５ｍｉｎ，１４％一１６％Ｂ；２５—４５ｍｉｎ，１６％一３８％Ｂ，流速２ｍＬ・ｍｉｎ～，柱温３５℃，进样量１０“Ｌ；检测波长，葛根素、大豆苷、甘草酸铵为２５０ｎｍ；甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素为２７５ｎｍ；黄连碱、药根碱、小檗碱、巴马汀为３４５ｎｍ；理论塔板数均不低于３０００。２．２对照品溶液的制备分别精密称取葛根素、大豆苷、甘草苷、黄连碱、药根碱、黄芩苷、小檗碱、巴马汀、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和甘草酸铵对照品适量，加５０％甲醇配制成每ｌｍＬ分别含４８３．６，干燥根茎和豆科植物甘草Ｇｂｑ丌＾妇Ⅱｒ口ｆｅｍｂ的干燥根茎。２方法与结果２．１Ｆｉｓｃｈ．色谱条件ｍｍ×１００色谱柱ＭｅｌｌｃｋＣｈｒｏｍｏｌｉｌｈＲＰ－１８ｅ３６．２８，１４．“，７６．３２，１６．８２，中¨．４，３８０．０，７７．６０，７１．３６，３５．８０，１５．２６，１４．０３“ｇ的混合对照品溶液。・５９・（４．６ｍｍ）；流动相Ａ０．０５％磷酸（含０．０１万方数据第１７卷第１５期２０１１年８月中国实验方剂学杂志ＣｈｉｎｅＢｅＪｏｕｍａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｍｄｉｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃａｌＶ０１．１７．Ｎｏ．１５Ｆｏ咖ｕｌａｅＡｕｇ．，２０ｌｌ２．３供试品溶液的制备按２０１０年版《中国药典》一部”１葛根芩连处方比例称取葛根３２ｇ、黄芩１２黄连１２ｇ、炙甘草８ｇ，加水５１２ｍＬ，先浸泡３０ｇ、密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各１０斗Ｌ，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图ｌ，２，１２个成分分离良好，阴性无干扰。２．５线性关系考察取１２个对照品，分别用５０％甲醇配制成５个不同质量浓度，见表３，分别精密吸取１０斗Ｌ注入液相色谱仪，按２．１项下色谱条件测定峰面积，以对照品质量浓度（ｍｇ・Ｌ。）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，标准曲线、相关系数和线形范围见表４，１２个成分均呈良好的线性关系。ｍｉｎ，煎煮２ｈ，药渣再加水５１２ｍＬ煎煮２ｈ，煎煮液趁热过滤（１００目筛网），放冷，合并两次滤液，用水定容至２０００ｍＬ，作为饮片水煎液。取饮片水煎液，摇匀，精密量取混悬液１０ｍＬ，置２５ｍＬ量瓶中，加甲醇１４ｍＬ，超声处理３０ｍｉｎ，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用０．４５斗ｍ微孔滤膜滤过，即得。２．４专属性试验按２．３项下方法分别制备去除葛根、黄芩、黄连和炙甘草的阴性样品溶液。分别精。ｍｌＡ２５０姗Ｏ５１０１５２０２５３０３５４０Ｏ５ｌＯ１５２０２５３０３５４０矿了１矿１—旷曩—矿强■矿∥ｍｉｎ“ｍｉｎ∥曲Ｏ５ｌＯ１５２０ｔ｜∞证ｔ｜∞过ｔ｜池圈ｌ对照晶（Ａｌ豆供试品ｌＢＪ在３个检测波长下ＨＰＬＣ２５３０３５４０４５Ｏ５ｌＯ１５２０２５３０３ｊ４０”Ｏ５ｌＯ１５２０２５３０３５４０４５１．葛根素；２．大豆苷；３．甘草苷；４．黄连碱；５．药根碱：６．黄芩苷；７．小檗碱；８．巴马汀；９．汉黄芩苷；ｌＯ．黄芩素；１１．汉黄芩素；１２．甘草酸铵・６０・万方数据章军，等：ＨＰＬｃ同时测定葛根芩连汤中１２个有效成分的含量Ｏ５ｌＯ１５２０２５３０３５４０４５０５ｌＯ１５２０２５３０３５４０４５Ｏ５１０１５２０２５３０３５４０４５．荫ｍｉｎｆ／ｌｎｉｎｆ／ｍｉｎＯ５ｌＯ１５２０２５３０３５４０４５Ｏ５１０１５２０ｔ｝ｍ．ｍｔｉ蛾２５３０３５４０４５Ａ．葛根阴性；Ｂ．黄芩阴性；Ｃ．黄连阴性；Ｄ．炙甘草阴性圈２明性样品在３个检测波长下ＨＰＬＣ衰３１２个成分线性关系考察对照品溶液浓度ｍｇ・Ｌ“裹４１２个成分线性关系考察２．６精密度试验精密吸取同一供试品溶液，重复进样６次，计算１２个成分峰面积的ＲＳＤ，结果见表５。２．７稳定性试验按２．３项下方法制备供试品溶液，分别于０，２，４，６，８，１２，２４ｈ，精密吸取ｌＯ斗Ｌ，按２．１项下色谱条件测定，计算１２个成分峰面积的ＲＳＤ，结果见表５。２．８重复性试验按２．３项下方法制备６份供试品溶液，按２．１项下色谱条件测定１２个成分含量，并计算ＲＳＤ，结果见表５。２．９加样回收率试验采用加样回收法（按１：１加入），精密量取已知含量的６份饮片水煎液各５ｍＬ．分别置２５ｍＬ量瓶中，精密加入适量混合对照品溶液，摇匀，按２．３项下方法制备供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液１０斗Ｌ，按２．１项下色谱条件测万方数据’・６１・第１７卷第１５期２０１１年８月中国实验方剂学杂志Ｃｈｉｎｅ８ｅＪｏｕｍａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃａｌＶ０１．１７．Ｎｏ．１５Ｆｏ咖ｕｌａｅＡｕｇ．，２０ｌｌ裹５１２个成分的精密度、稳定性、重复性ＲＳＤ和回收率试验％定，计算１２个成分的平均回收率和ＲＳＤ，结果见表５。２．１０含量测定取３批葛根、黄芩、黄连、炙甘草饮片按２．３项下方法制备成３批葛根芩连汤，再分别制备成供试品溶液，按２．１项下色谱条件测定１２个成分含量，结果见表６。３讨论葛根芩连汤中有效成分为黄酮类、生物碱类和皂苷类，最大吸收波长不一样，因此采用各成分的最大吸收波长作为检测波长。本试验经过多次ｊ｜｛ｆｌ整流动相组成、比例，最终得到使１２个成分能够较好分离的色谱条件。在此条件下，各峰分离度良好（＞１．５），理论塔板数均大于３０００，阴性无干扰。此外，运行时间短，仅需４５ｍｉｎ。比现有文献¨４２１检测成分多，效率高。表６批次ｌ２３３批葛根芩连汤水煎液中１２个成分药根碱１５．８４１６．７４１７．２８葛根索３４４３４３３５０大瓦苷５２．３５６．３６２．０甘草苷１８．１６１６．７６１９．３２黄连碱９２．４８８．８９０．４黄芩苷４３０４３９４１６小檗碱３２６３３９３４８巴马汀５７．９６５．５６５．９汉黄芩苷７５．６７４．６７０．４黄芩素２４．９２８．９２８．７汉黄芩衰１４．９３１４．７６１４．９２甘草酸铵１６．５８１４．０６１５．３６临床患者服用中药汤剂时采用纱布过滤，滤液中存在大量沉淀物，有文献报导沉淀中含有葛根素、黄芩苷、小檗碱和甘草酸ｐ…，不能将沉淀简单抛弃，因此本试验在制备供试品时没有采用滤纸过滤，而采用１００目筛网过滤，以贴近临床实际，考察供试品溶液制备方法时发现，加入甲醇可使沉淀溶解，因此采用水煎液甲醇稀释的制备方法，然后考察了甲醇用量和超声时间，最终确定了２．３项下的制备方法。该方法操作简单、专属性强、待测成分同收率高。本试验测定了葛根芩连汤中全部４味药材的有效成分，能够全面的控制汤剂的质量。试验结果显示１２个成分的重复性、稳定性良好，回收率合格。可应用于葛根芩连汤的质量控制。【参考文献］ｒＬ５１Ｊ吕元琦，李新民，袁倬斌．毛细管胶柬电动色谱法快速测定葛根素和大豆甙元［Ｊ］．化学工程师，２００５（１）：２８．６１Ｊ张科卫，蔡皓，池玉梅，崔小兵，等．ＨＰＬＣ双波长法测定葛根芩连微丸中葛根素、黄芩苷的含量［Ｊ］．中成药，２００５，２７（１）：４６．７１Ｊ罗奇志，戴开金，马安德，等．葛根芩连汤及微丸中葛根素、大豆苷元的ＨＰＣＥ分析［Ｊ］．药物分析杂志，２００４。２４（１）：１１．ｒＬ８１Ｊ朱斌．葛根芩连微丸中小檗碱、巴马汀的含量测定［Ｊ］．中药材，２０００，２３（１０）：６４１．ｒＬ９１ＪＣｈｅｎＬｉｈｏｎｇ，ａｎａｌｙｓｉ８ｗａｎｇＱｉａｎｇ，ａｃｔｉｖｅＬｉｕＪｉｎｉｎｇ．ｉｎＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕ８Ｇｅｇｅｎｏｆｎｉｎｅｂｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ８Ｑｉｎｌｉａｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ８ｈｉｇｈ—ｐｅＩｆｏ珊ａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｌ即ｐｈｙｗｉｔｈｄｉｏｄｅａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．２００６，２９：２２０３．ｍ［１］刘渡舟．伤寒论语译［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９９０：７３．罗佳波，谭晓梅，余林中，等．葛根芩连汤配伍规律的研究［Ｊ］．中草药，２００５。３６（４）：５１２．陈丽红，王强．葛根芩连汤不同配伍对黄芩苷、小檗碱含量的影响［Ｊ］．西北药学杂志，２００５，２０（４）：１４７．曹佩雪，梁光义，李霞，等．葛根芩连汤不同配伍情况下葛根素、黄芩苷、小檗碱的含量比较［Ｊ］．中国医药学报，２００３，１８（８）：４５９．［２］［３］［４］中国药典．一部［ｓ］．２０１０：１１４６．崔向微．张贵君，李慧．葛根芩连汤中７种药效组分分析［Ｊ］．天津中医药，２００８，２５（５）：４１７．谭晓梅，吴艳萍，吴昭晖．葛根芩连微丸中黄芩苷和小；１ｊ¨佗檗碱的含量及其溶出度测定［Ｊ］．中药材，２００６，２９（２）：１９５．・６２・万方数据［责任编辑蔡仲德］
