实时荧光核酸恒温扩增技术和液体培养法在不孕不育人群解脲
脲原体检测中的应用比较
包杰;陈丹
【摘 要】目的 比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法在解脲脲原体(UU)检测中的诊断价值,以选择更为准确、快速、实用的临床检测方法.方法 采集本院就诊的不孕不育对象200例的分泌物2份拭子样本,分别用于液体培养法和SAT法检测.结果 液体培养法阳性率为60%,SAT法阳性率为47%,培养法阳性率高于SAT法,女性UU阳性率显著高于男性,26例结果不一致中有11例培养阴性SAT阳性,15例培养阳性而SAT阴性,SAT法的敏感性(100%)和特异性(93.5%)均高于培养法.结论 解脲脲原体在不孕不育人群中感染率较高,加强就诊对象UU的筛查、诊治和预防,确保优生优育.SAT技术简便、快速、精准,具有较高的临床实用性,是适合实验室诊断的检测方法. 【期刊名称】《实验与检验医学》 【年(卷),期】2017(035)005 【总页数】4页(P673-676)
【关键词】不孕不育;解脲脲原体;实时荧光核酸恒温扩增技术;液体培养法 【作 者】包杰;陈丹
【作者单位】河南省人口和计划生育科学技术研究院,河南 郑州 450002;河南省人口和计划生育科学技术研究院,河南 郑州 450002 【正文语种】中 文
【中图分类】R375+.3;R446.5;R698+.2;R711.6
解脲脲原体 （UU）感染可引起泌尿生殖道疾病，是常见的性传播疾病，在30%～40%的不孕不育人群中非淋菌性尿道炎是由解脲脲原体感染所致。近年来UU感染率迅速上升趋势更加明显，且在女性中的感染率更高，对人体生殖系统的健康造成了极大危害，已经成为严重的公共卫生问题。目前临床检测UU的方法多为液体培养法，它是通过UU分解不同底物改变其pH，使液体培养基发生颜色变化来判断，但能分解尿素的细菌均可导致培养基颜色的变化，故单纯靠颜色变化来判断是否有UU感染会存在假阳性，且灵敏度低、用时长，因此，寻找准确、快速、实用的检测方法有着重要的意义[1]。实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT）作为新一代的核酸扩增检测技术现已被广泛应用到病原体检测领域，该技术具有高灵敏性、高特异性、低污染、反应稳定等优点[2]。本研究随机选取了本院前来就诊的200例不孕不育对象，采集男性尿道分泌物和女性阴道分泌物，同时应用液体培养法和实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT）进行UU的检测，对这2种方法的诊断价值在临床上的应用进行比较，现将结果报告如下。
1.1 样本来源 2017年3-5月来自本院门诊妇科、男科、生殖科或中医科就诊的不孕不育患者200例，年龄20～45岁，其中男性68例、女性132例。要求所有人员在标本采集的前7～10d，禁止采用抗菌药物。所有人员在身体方面没有明显差异，无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 样本采集用特制无菌棉拭子伸入女性宫颈口或男性尿道口约1～2cm，旋转1周，停留10s后取出，第一个棉拭子立即加入1ml液体培养基中接种培养，第二个棉拭子放入1ml生理盐水中浸泡，洗脱后取出，取0.5ml洗涤液加0.5ml尿样保存液 （SAT试剂盒提供）混合作UU-SAT待测样本，用EP管保存于-20℃冰箱。 1.3 试剂与方法
1.3.1 试剂 液体培养鉴定药敏试剂盒 （UU+MH）生产厂商是郑州安图绿科生物
有限公司，SAT法恒温扩增检测试剂盒（UU-RNA）由上海仁度生物科技有限公司提供，TL 988 PCR仪由西安天隆科技有限公司提供。
1.3.2 方法严格按照试剂盒的说明进行操作检测，SAT预留标本从冰箱取出平衡至室温后，按试剂盒说明书进行UU-SAT检测。 1.4 样本检测
1.4.1 培养鉴定将分泌物拭子洗脱入培养基后，置37℃培养箱中24～48h，结果判断严格按说明书进行。
1.4.2 SAT检测按照试剂盒说明书操作，设置阴、阳性对照。取400μl加有尿样保存液的预留样本和100μl核酸提取液混匀，60℃恒温5min，室温放置10min，置磁珠分离器上静置5min，加入洗涤液洗涤2次；加40μl反应液提取RNA，吸取30μl含磁珠的扩增检测液至8连管中60℃恒温10min、42℃恒温5min，加入预热的SAT酶液10μl，42℃实时恒温扩增40min[3]。
1.5 结果判断⑴液体培养法于24h或48h观察结果，解脲脲原体（UU）阳性时生成的碱性物质会与培养基中的尿素发生反应，分解精氨酸，导致PH值上升，若培养液由黄色变成红色，透明无混浊，则为阳性。⑵SAT法检测结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阴、阳性对照和界值参考品对检验结果进行判定。dt≤35的样本为阳性；dt为40或无数值的样本为阴性；35＜dt＜40的样本建议重新检测，结果dt＜40的样本为阳性（dt为阈值线与样本曲线交点的横坐标读数，与PCR结果的Ct值类似）[5]。⑶以2种以上(包括2种)检测方法的结果均阳性为真阳性，结果均阴性为真阴性。灵敏度=真阳性例数/(真阳性+假阴性)例数×100%。特异度=真阴性例数/(真阴性+假阳性)例数×100%。
1.6 统计学分析 UU培养法和SAT法检测结果采用SPSS 13.0统计学软件中的配对χ2检验进行统计学分析，结果以率表示，P＜0.05表示差异有统计学意义[4]。 2.1 UU培养和SAT检测结果阳性率比较
2.1.1 200例受检者中UU培养法阳性率为60%，UU-SAT法阳性率为47%，其中女性UU培养与UU-SAT阳性率分别为66.7%、54.5%，男性UU培养与UU-SAT阳性率分别为47.1%、32.4%，培养法阳性率均高于SAT法，女性UU阳性率显著高于男性（P＜0.01）。2种方法的检测结果见表1。
2.2 敏感性和特异性比较 200例受检者用2种方法检测UU时有26例结果不一致，其中11例培养阴性SAT阳性，15例培养阳性而SAT阴性。通过感染者真阴性、真阳性的比较得出培养法的敏感性和特异性分别为91.4%、83.3%，SAT法的敏感性和特异性分别为100%、93.5%，SAT法的敏感性和特异性均高于培养法，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。2种方法的敏感性和特异性见表2。
支原体是存在于人类泌尿生殖系统中的病原微生物，侵犯泌尿生殖道黏膜上皮，可引起非淋菌性尿道炎，生殖器慢性炎症，导致男女不孕不育。据报道支原体感染增加男性不育风险5倍多[6]，其感染影响精子活力，减低精子数量，干扰精卵结合，并可引起男性慢性前列腺炎、附睾炎等。女性感染未经治疗可引起盆腔炎和宫颈炎，并使输卵管黏膜上皮细胞受到损害，引起其炎性反应而导致阻塞或障碍，由支原体感染引起的输卵管性不孕症占22%。孕妇感染会造成母婴垂直传播与感染，引起婴儿结膜炎、肺炎等新生儿感染，有部分研究表明支原体感染可能与习惯性流产、胚胎停育等生育异常相关。UU感染者大多数为隐匿性感染，常无症状或症状不明显，因此易忽略就医常被漏诊，为发现无症状的患者，临床多建议不孕不育患者进行常规UU筛查。传统的UU检测方法有涂片、培养、免疫学等，都存在检出率低、周期较长、特异性差等缺点，给诊断和治疗带来困难，因此，建立高敏感、高特异、快速便捷的实验室诊断方法控制该疾病的传播，对临床诊断和经验治疗有重要意义[7]。本研究采用液体培养法和SAT技术对本院就诊的不孕不育对象的分泌物样本进行UU检测，分析不孕不育与支原体感染的相关性，并为其检测治疗提供合理的方法学和依据[8]。
临床实验室多采用液体培养法检测UU，其依据培养基颜色变化来判断有无UU的生长，主观性强，易造成假阳性或假阴性结果，且培养常需24～48h，但由于液体培养法操作简单、经济方便，可同时进行药敏试验，帮助临床指导用药，是目前包括基层在内的大部分医院最常用的检测方法。SAT法是一种新型RNA检测技术，近年在国内病原体诊断领域发展快速[9]，临床上常应用于检测CT、UU、NG、MG等，该技术将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合，无须高速离心、高温加热，特异性提取尿液或拭子样本中的病原体RNA；RNA在环境中极不稳定，容易降解，交叉污染少，可有效降低核酸扩增检测引起的假阳性问题，有助于临床疗效监测；SAT采用磁珠法对特异性靶标进行捕获扩增检测，水相洗涤，最大限度去除杂质，有效减少假阴性，尤其是当患者正处于感染初期，病原体DNA量较少，RNA量相对较多时SAT技术更能显示出其高敏感性 [10]。SAT法检测的是病原体16sr RNA，只有活菌中才有完整的RNA片段，因此相当于检测活的病原体，此法既增加了液体培养法的灵敏度，又增加DNA检测方法的特异性[11]，避免了机体残留病原体DNA片段的影响，阳性可提示病原体处于活性状态，对诊断有重要意义。患者经治疗后病菌死亡、临床症状消失，RNA在死亡的病原体中降解快速，有利于临床用药后的疗效观察及判愈，避免造成过度治疗，增加患者心理和经济负担。这也说明用SAT检测技术进行用药疗效判定有一定价值，SAT检测阴转提示已治愈，并为治愈后的复检以及临床用药提供了参考方案[12]。有研究表明，UU-SAT在尿液和拭子检测中的结果无差异，首段尿标本与拭子的敏感性相当，说明SAT法可以使用泌尿生殖道分泌物或尿液作检测样本，由于部分无症状患者对生殖道检查取样的排斥，做非侵入性的尿液样本检测更易于采集接受，避免拭子取样的尴尬和痛苦，提高了患者取样的依从性，减少了医生的工作量，简化了收集流程，具有较大的临床应用价值[13]。
研究结果表明，200份标本中培养法与UUSAT阳性率分别为60%、47%，SAT
法与国内文献结果报道的不育不孕患者的UU阳性率更相近，SAT法低于培养法阳性率13%，该方法检测的假阳性率明显低于培养法。其中26例培养和SAT检测结果不一致，出现11例SAT检测阳性而液体培养阴性的可能原因有：培养过程中分泌物中存在某些微生物抑制了UU的生长繁殖，或在进化过程中UU发生突变，不分解尿素，没有使培养基颜色改变；受检者正处于感染初期，病原体DNA量少而RNA量多，SAT技术能检测到病原体RNA的存在等。出现15例SAT检测阴性而液体培养阳性的可能因素：拭子样本中含有一些亦能分解尿素的细菌或真菌，菌量超过培养基抗生素抑制能力而导致液体培养变红，出现假阳性；SAT样本中的UU含量较低、存在扩增抑制物或样本保存不当造成RNA降解等。目前的观点认为，UU阳性只提示泌尿生殖道UU的存在，不能作为泌尿生殖道感染确诊的依据，当病原菌达到一定的量（≥104CFU/ml）或出现临床症状才需给予临床治疗[14]。
本研究结果显示，UU在不孕不育患者感染中增加趋势明显，且女性的阳性率明显高于男性，说明支原体对女性生殖道感染的影响严重，孕前应积极预防和治疗UU的感染，从而提高UU感染所致不孕症的治愈率。通过了解不孕不育人群中支原体的感染情况发现，在UU感染者中无症状患者占50%，提示多加防范检测对象的漏诊，为避免未及时检测与就诊延误病情导致继发感染或影响胚胎及胎儿发育等隐患，建议拟生育的夫妇虽无症状，也应做相关检测，对于阳性患者，及早治疗，确保优生优育[15]。本研究通过SAT法与液体培养法检测UU的结果比较，应用SAT法可以帮助辨别培养造成的假阳性，对无症状患者和已治疗但未完全清除的患者，标本中含量不高的病原微生物，SAT法可以更好的检测出，避免漏检[16]。 总之，SAT技术在临床应用中，既具备采样方便、耗时短、低污染的实验要求[17]，又有敏感性高，特异性好，反应稳定，结果准确可靠等优点，还可用于用药后的疗效和判愈，帮助及时调整药物，减少耐药菌产生的机会，辅助进行临床判愈评估
[18]，并为支原体的实验室诊断提供新的采样方式和检测方法，该技术更具有临床实用性，优于目前其他检测方法，是一种值得推广的检测方法。
【相关文献】
[1]李林海，陈丽丹，刘文婷，等.实时荧光核酸恒温扩增技术和液体培养法检测解脲脲原体的比较[J]．生物技术通讯，2013，24（2）：251-253．
[2]曾成龙，冯婷，闫丹，等.液体培养法、PCR法和SAT法在解脲支原体检测中的应用比较[J].中国麻风皮肤病杂志，2016，32（7）：397-398．
[3]张颖，赵琼珍，李彦奇，等.不孕不育人群生殖支原体感染情况研究及疗效评估[J].医学，2015，45（12）：1771-1773．
[4]陈婷婷，钱煦岱，包文婷，等.SAT技术检测解脲脲原体和沙眼衣原体核酸在泌尿生殖道感染中的应用 [J].中国卫生检验杂志，2015，25（14）：2357-2359.
[5]顾伟鸣，杨阳，吴磊，等.实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染[J].临床检验杂志，2010，28（4）：271-272.
[6]杨华君，惠亚，施尚鹏，等.解脲脲原体和沙眼衣原体感染对男性不育影响的 Meta 分析[J].中国男科学杂志，2015，29（5）：36-42．
[7]周璐，蔡筠，谢建生.实时荧光核酸恒温扩增技术在不孕育龄妇女病原体检测中的应用研究[J].医药前沿，2013，3（21）：55-56.
[8]高玉芳，赵联营，穆丽萍．不孕症患者生殖道支原体培养及耐药性分析[J].现代检验医学杂志，2013，28（5）：135-137．
[9]修文琼，郑奎城，吴冰珊，等.实时荧光PCR方法快速检测KI多瘤病毒[J].实验与检验医学，2016，34（1）：11-14．
[10]郑雅萍，袁青，陈伟，等.不同核酸检测方法检测非淋球菌性尿道炎病原体[J].浙江预防医学，2015，27（5）：535-537．
[11]孔小祥，仲崇明．实时荧光定量PCR检测HBV-DNA测量不确定度的评定[J].实验与检验医学，2016，34（4）：425-427．
[12]苏静秋，张绍武，张艳君.不孕妇女沙眼衣原体和解脲支原体感染检测分析[J].中国误诊学杂志，2011，11（22）：5334-5335.
[13]张睿，叶阿里，孔令君，等.临床患者三种性传播疾病分子生物学检测分析[J].现代检验医学杂志，2015，30（3）：107-110.
[14]张艳，李苏利.解脲支原体检测方法研究现状[J].临床军医杂志，2014，42（9）：961-963. [15]林永恩.女性泌尿生殖道支原体.解脲体支原体感染与不孕的相关性分析[J].现代中西医结合杂志，2010，19（22）：2822-2823.
[6]贾艳艳，张永良．荧光定量PCR对解脲脲原体及沙眼衣原体的检测分析[J]．国际检验医学杂志，
2014，35（8）：1075-1076．
[17]高志华，金印，陈峰.实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中淋球菌的分析[J].国际检验医学杂志，2012，33（4）：463-4.
[18]贺望娇．522例患者沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌感染情况分析[J]．检验医学与临床，2013，10（7）：826-827．
